ชุดทดสอบสารพิษเตโตรโดท็อกซิน (Tetrodotoxin) มาตรการการดำเนินการป้องกันและแก้ไขปัญหาปลาปักเป้า ชุดทดสอบสารพิษเตโตรโดท็อกซิน (Tetrodotoxin) อารี ทัตติยพงศ์ กรมวิทยาศาสตร์การแพทย์ โรงแรม มิราเคิล แกรนด์ 24 กันยายน 2552

เตโตรโดท็อกซิน (Tetrodotoxin: TTX) *เป็นสารพิษที่พบ ในปลาปักเป้า (puffer fish) แมงดาถ้วย *น้ำหนักโมเลกุลน้อย 319.3 ดาลตัน *Heat stable ทนความร้อนได้ถึง 170oC *มีฤทธิ์ต่อระบบประสาท โดย block sodium channel อาการชาที่ริมปาก มือ เท้า กล้ามเนื้ออ่อนแรงเป็นอัมพาต หายใจขัด อาการพิษเกิดภายใน 10-45 นาที สูตรโครงสร้าง C11H17N3O8

ประเทศไทย: กำหนดให้ TTX ปนเปื้อนได้ไม่เกิน 10 MU (2.2 ppm) ญี่ปุ่น: เป็นประเทศบริโภค ปลาปักเป้ามากที่สุด ได้ศึกษาความเป็นพิษของ TTX พบว่าสารพิษ 10,000 MU (2 mg) เป็นอันตรายต่อชีวิตผู้บริโภค เกาหลี: กำหนดให้มีสารพิษปนเปื้อนในเนื้อปลาปักเป้าได้ 10 MU (1 MU: mouse unit หมายถึงปริมาณสารพิษน้อยที่สุดที่สามารถ ฆ่าหนูขาวตัวผู้หนัก 20 กรัม ได้ภายในเวลา 30 นาที มีค่าเท่ากับ 0.22 ไมโครกรัม) ประเทศไทย: กำหนดให้ TTX ปนเปื้อนได้ไม่เกิน 10 MU (2.2 ppm)

วิธีวิเคราะห์สารพิษเตโตรโดท็อกซิน  ศึกษาความเป็นพิษ : Mouse bioassay  วิเคราะห์ปริมาณ : HPLC, LC-MS/MS (วิธีมาตรฐาน) วิธีตรวจกรอง ชุดทดสอบ

หลักการ Immunochromatography

ส่วนประกอบของชุดทดสอบ backing Absorbent pad (Wick) Control line Test line Conjugated pad Sample pad

ปริมาณ TTX ต่ำสุดที่ detect ได้ = 2 ppm LIMIT OF DETECTION 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 2.4 2.8 ppm ปริมาณ TTX ต่ำสุดที่ detect ได้ = 2 ppm

วิเคราะห์ความถูกต้องของชุดทดสอบ ทดสอบกับ known sample 99 ตัวอย่าง (ประเมินในห้องปฏิบัติการ) HPLC + - + - 58 (TP) 6 (FP) 64 4 (FN) 31(TN) 35 62 37 99 TTX-IC ความไว 58/62 = 93.5% ความจำเพาะ 31/37= 84.0%

วิเคราะห์ความถูกต้องของชุดทดสอบ (ต่อ)  Spike std TTX ลงในสารสกัดแล้ววิเคราะห์ด้วยชุดทดสอบ TTX (ppm) ผลการทดสอบ 0.556 - 1.356 - 1.756 - 2.156 + 2.556 + TTX (ppm) ผลการทดสอบ 0.636 - 1.436 - 1.836 - 2.236 + 2.636 +

ทดสอบ cross-reaction กับ sasitoxin ตัวอย่าง HPLC (Sasitoxin) TTX-IC 1. น้ำแกง 1 + - 2. น้ำแกง 2 + - 3. Urine 1 - - 4. Urine 2 - - 5. Std TTX 2 ppm nd + 6. Std Sasitoxin + -

ทดสอบ cross-reaction สารสกัดจากปลาอื่นๆ 31 ตัวอย่าง ผลลบทุกตัวอย่าง ตัวอย่างจาก สคอ. กรมวิทย์

ศึกษาความไวและความจำเพาะ ตัวอย่าง จำนวน TTX-IC ผลบวก(%) ผลลบ (%) L. lunaris 20 2 (10) 18 (90) L. spadeceous 93 8 (8.6) 85(91.4) ปลาปักเป้าพิษ 2 1(ไข่) 1 (เนื้อ) รวม 113 10(8.85) 103(91.15) ประเมินที่สมุทรสาคร โดย ศวก. สมุทรสงคราม

ตัวอย่าง TTX-IC LC-MS/MS สรุปผล ตรง ผลลบ < 2ppm 1 - 2 3 4 5 6 7 8 9 0.76 ตรง 2 0.75 3 0.93 4 0.19 5 1.54 6 1.41 7 0.81 8 0.52 9 1.03 10 0.53 11 12 0.41 ผลลบ < 2ppm ยืนยันผลด้วย LC-MS/MS ที่ สคอ. กรมวิทย์ฯ

ตัวอย่าง TTX-IC LC-MS/MS สรุปผล ไม่ตรง ตรง ผลบวก >2ppm 1 + 2 3 4 5 1.39 ไม่ตรง 2 2.85 ตรง 3 1.52 4 3.55 5 4.52 6 5.67 7 6.93 8 4.90 9 4.88 10 1.26 11 216.83 ผลบวก >2ppm ยืนยันผลด้วย LC-MS/MS ที่ สคอ. กรมวิทย์ฯ

ศึกษาความไวและความจำเพาะ LC-MS/MS + - + - 8 (TP) 3 (FP) 11 0 (FN) 12 (TN) 12 8 15 23 TTX-IC ความไว 8/8 = 100% ความจำเพาะ 12/15= 80.0% ไม่มีผลลบปลอม (ประเมินในภาคสนามที่จังหวัดสมุทรสาคร)

1. การเตรียมตัวอย่าง บดตัวอย่าง ชั่ง เติม acetic acid 4เท่าของตัวอย่าง(v:w) ต้มในน้ำเดือด 10 นาที

2. วิธีทดสอบ 3. อ่านผล ผลบวก: TTX> 2 ppm ผลลบ: TTX< 2 ppm ดูดส่วนใสหยดบนชุดทดสอบ 3 หยด ตั้งไว้ 5 นาที 3. อ่านผล ผลบวก: TTX> 2 ppm ผลลบ: TTX< 2 ppm

สรุป ชื่อชุดทดสอบ TTX-IC ตรวจวิเคราะห์สารพิษเตโตรโดท็อกซินในปลาปักเป้าน้ำเค็ม หลักการ Immunochromatographic assay ไม่มีปฏิกิริยาข้ามกันกับ Saxitoxin ที่พบในปลาปักเป้าน้ำจืด LOD 2 ppm. Cut-off value 2 ppm. ความไว 100% ความจำเพาะ 80%