สำนักงานป้องกันควบคุมโรคที่ 10 เชียงใหม่ การศึกษาเปรียบเทียบผลการวิเคราะห์ตรวจหา Lactate ในเลือดด้วยเทคนิค HPLC กับ เทคนิค Enzymatic Assay

Blood Lactate cyberlab.lh1.ku.ac.th/elearn/faculty/veterin

Blood Lactate http://www.vet.ku.ac.th/std/CAI/physio/47/biochem/first_sem/wn/gluconeogenesis_47.ppt#256,1

Medical treatment of HIV ARV (Antiretroviral drug) AZT (ปี 2533) ►HAART (ปี 2542) 1. Nucleoside analogues reverse transcriptase inhibitors (NRTIs) 2. Non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors (NNRTIs) 3. Protease inhibitors (PI) 4. Nucleotide reverse transcriptase inhibitors (NtRTIs) 5. Fusion inhibitor 6. CCR5 inhibitor www.aidsthai.org

สูตรยาสูตรพื้นฐานโดยกรมควบคุมโรค(ปี 2547) สูตรที่ 1 d4T/AZT +3TC +NVP (GPO-VIR) สูตรที่ 2 d4T/AZT +3TC +EFV สูตรที่ 3 d4T/AZT +3TC +IDV/RTV ทุกสูตรยาประกอบด้วยยาในกลุ่ม NRTIs อยู่ คือ d4T, 3TC, AZT

Nucleoside Analogue Reverse Transcriptase Inhibitors (NRTIs) Sanjeev et al., 1999

NRTI abrogation HIV-1 replication Nikolenko, Galina N. et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 2093-2098

Adverse effect; Lactic acidosis NRTIs ► Inhibit DNA polymerase gamma ▼ Inhibit oxidative phosphorylation ▼ Mitochondria toxicity www.gcarlson.com

Glucose Glycolysis pyruvate ▼ fermentation aerobic cellular respiration http://www.sc.chula.ac.th/courseware/bio-u2/ppt/b09.ppt#288,33

การตรวจหาแลคเตทในห้องปฏิบัติการ ผู้ป่วยที่รับยา NRTIs Asymptomatic hyperlactatemia; prevalence = 15-35% Symptomatic hyperlactatemia; incidence = 13 ราย/ 1,000 รายต่อปี Severe hyperlactatemia; mortality rate = 57% Calza et al., 2005 Falco et al., 2002

การตรวจหาแลคเตทในห้องปฏิบัติการ (ต่อ) Lactic acid Chemical name ; 2-hydroxypropanoic acid Chemical formula ; C3H6O3 Molecular mass ; 90.08 g/mol CAS number ; [50-21-5] Melting point ; 53๐C Boiling point ; ; 122 °C @ 12 mmHg www.wikipedia.org

การตรวจหาแลคเตทในห้องปฏิบัติการ (ต่อ) ความต้องการ NRTIs+clinical sign Lactate=2-5 mM ปัญหา ตรวจวัดระดับแลคเตทในเลือด, ส่วนใหญ่ยังไม่มี การวินิจฉัยล่าช้า Clinical sign ไม่จำเพาะ โรงพยาบาลส่วนใหญ่ใช้ Anion gap Bicarbonate concentration Clinical sign ▼ อาการแย่ลง ▼ แก้ไข

การตรวจหาแลคเตทในห้องปฏิบัติการ (ต่อ) การแก้ไขปัญหา พัฒนาวิธีตรวจ (HPLC) โดยเปรียบเทียบกับ enzymatic assay ช่วยเหลือการติดตามดูแลผู้ป่วย ข้อมูล; ระบบหน่วยงานสาธารณสุข

Literature review Lactic acidosis; arterial pH ≤ 7.35, hyperlactatemia HPLC technique Bleiberg et. al,1991 ; isocratic HPLC UV detector, derivatization (serum), calibration curve linearity = 0.18-6.0 mM, analytical recovery = 87% (สัญชัย ชาสมบัติและคณะ 2547)

Literature review (cont.) HPLC technique Minniti et. al (2001) ; HPLC (gradient), diode array detector, ion exclusion column, mobile phase = sulfuric for HPLC-MS system (serum, CSF) Cheng C et. al (2001), Cheng F et al.(2000) ; UV detector, ion exchange column,mobile phase = sulfonic acid 4mM (dialysates)

Literature review (cont.) Hasegawa et. al (2003); column-switching HPLC pre-column fluorescence derivatization (serum) Intra-day and inter-day accuracies = 90.5-101.2 and 89.0-100.7%

Objective เปรียบเทียบผลการวิเคราะห์ตรวจหา Lactate ในเลือดด้วยเทคนิค HPLC กับ เทคนิค Enzymatic Assay

Research design Develop HPLC method Validate HPLC method เปรียบเทียบวิธีวิเคราะห์ HPLC & Enzymatic assay (Guidance for industry bioanalytical method validation 2001)

การพัฒนาวิธี HPLC Column: HydroBond AQ C18 4.6 x 250 mm, 5 um       Mobile Phase: 0.05M NaH2PO4 99%,acetonitrile 1% pH 2.4 Flow Rate:1.0 mL/min Sample: 1. Oxalic acid 2. Tartaric acid 3. Formic acid 4. Malic acid 5. Malonic acid 6. Lactic acid 7. Maleic acid 8. Fumaric acid Agilent ZORBAX Column Selection Guide for HPLC 2004

การวัดปริมาณแลคเตทด้วยวิธี HPLC

การพัฒนาวิธี HPLC (ต่อ) ทดสอบสภาวะที่เหมาะสม Mobile Phase ; NaH2PO4 20 mM pH 2.63, isocratic Flow rate ; 0.8 ml/min Column ; reverse – phase C18 stable bond, 35๐C Wavelength ; 210 nm Injection volumn ; 100 ul

Standard lactate HPLC chromatogram Standard lactate 20 mM RT = 3.18 ± 0.25 min

Method validation Linearity Sensitivity Specificity Accuracy Precision Reproducibility Stability Freeze & Thaw Stability Short-Term Temperature Stability Long-Term Stability Post-Preparative Stability Guidance for industry bioanalytical method validation 2001

Linearity Lactate (mM) Peak area (Mean ± S.D.) 1.25 2.50 5.00 7.50 10.00 15.00 1.05 ± 0.05 2.06 ± 0.12 3.53 ± 0.10 5.32 ± 0.09 7.43 ± 0.13 10.75 ± 0.06 Linearity Slope = 0.71

Sensitivity Conc. mM Mean ± S.D. Accuracy %CV 0.625 0.594 ± 0.093 95.07% 15.65 LOD = 0.625 mM LOQ = 1.25 mM

Specificity

Specificity (Cont.) propionic acid Lactic acid propionic acid

Specificity (Cont.) Area 4.33722 Amount 6.357 mM/L Area 4.09951 Lactic acid Area 4.09951 Amount 6.02 mM/L (94.69%) Propionic acid Lactic acid

Accuracy; % recovery การทดลองครั้งที่ ปริมาณที่เติม1.25 mM 3 4 5 3.04 2.73 2.50 2.89 2.42 6.78 7.49 7.12 7.25 7.17 11.71 12.51 12.09 12.27 12.04 Mean 2.72 7.16 12.12 S.D. 0.26 0.29 %CV 9.56 3.60 2.40 Expected value 3.08 6.83 11.83 % Recovery 88.31 104.83 102.45

Intra-day Precision ครั้งที่ ปริมาณแลคเตท (mM) ซีรั่ม QC ระดับ 1 2 3 4 5 1.310 1.350 1.320 1.340 1.330 5.590 5.620 5.430 5.580 5.610 mean 5.650 S.D. 0.016 0.077 %CV 1.18 1.36

Inter-day Precision

การทดลองครั้งที่ ปริมาณแลคเตท (mM) ซีรั่ม QC ระดับ 1 ซีรั่ม QC ระดับ 2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1.41 1.40 1.35 1.42 1.38 1.36 1.45 5.83 6.15 5.35 6.36 5.14 5.80 5.77 5.48 5.85 mean 5.73 S.D. 0.06 0.36 %CV 2.07 6.26

ปริมาณแลคเตทที่ตรวจวัดได้ (mM) Stability Collecting tube ครั้งที่ ปริมาณแลคเตทที่ตรวจวัดได้ (mM) Mean ± S.D. NaF - OX tube EDTA tube 1 2(day 3) 3(day 7) 4(day 14) 1.16 ± 0.09 1.65 ± 0.09 1.33 ± 0.26 1.38 ± 0.02 1.33 ± 0.07 2.04 ± 0.10 2.09 ± 0.10 2.85 ± 0.09

Stability (cont.) Freeze & Thaw Stability: 3 cycles ครั้งที่ ปริมาณแลคเตทจากตัวอย่างที่มีค่าปกติ (mM) Mean ± S.D. ปริมาณแลคเตทจากตัวอย่างที่มีค่าสูง(mM) 1 2 3 1.16 ± 0.07 1.39 ± 0.03 0.87 ± 0.09 0.84 ± 0.03 12.69 ± 0.05 11.76 ± 0.59 11.13 ± 0.26 10.20 ± 0.41

Stability (Cont.) Short-Term Temperature Stability ครั้งที่ ปริมาณแลคเตทจากตัวอย่างที่มีค่าปกติ (mM) Mean ± S.D. ปริมาณแลคเตทจากตัวอย่างที่มีค่าสูง (mM) 1 2 3 4 5 1.16 ± 0.09 1.47 ± 0.04 1.43 ± 0.07 1.37 ± 0.04 1.48 ± 0.05 12.69 ± 0.05 11.63 ± 0.53 12.41 ± 1.04 13.34 ± 0.69

ปริมาณแลคเตทจากตัวอย่าง Stability (Cont.) Long-Term Stability ครั้งที่ ปริมาณแลคเตทจากตัวอย่าง ที่มีค่าปกติ (mM) Mean ± S.D. ที่มีค่าสูง (mM) Mean ± SD. 1 2 3 4 1.16 ± 0.09 1.65 ± 0.09 1.33 ± 0.26 1.38 ± 0.02 12.69 ± 0.05 12.29 ± 0.43 11.34 ± 0.25 12.04 ± 0.49 mean 1.38 12.09 S.D. 0.20 0.57 %CV 14.49 4.7

ปริมาณแลคเตทจากตัวอย่างที่มีค่าปกติ ปริมาณแลคเตทจากตัวอย่างที่มีค่าสูง Stability (Cont.) Post Preparative Stability ครั้งที่ ปริมาณแลคเตทจากตัวอย่างที่มีค่าปกติ (mM) Mean ± S.D. ปริมาณแลคเตทจากตัวอย่างที่มีค่าสูง 1 2 (2 hr) 3 (4 hr) 1.38 ± 0.02 1.71 ± 0.08 1.76 ± 0.09 8.52 ± 0.09 11.57 ± 1.07 13.11 ± 0.74

ตัวอย่างเลือด ตัวอย่างเลือดที่เหลือจากงานบริการที่จะใช้เปรียบเทียบวิธีวิคราะห์แลคเตท จำนวน 30 ตัวอย่าง

Enzymatic assay McLellan et al (1992) www.gmi-inc.com

Result (HPLC & Enzymatic assay) กลุ่มที่ 1 Normal (ต่ำกว่า 2 mmol/L) จำนวน 9 ราย 1.52 ± 0.34 mmol/L & 1.45 ± 0.24 mmol/L กลุ่มที่ 2 Moderate hyperlactatemia (2-5 mmol/L) จำนวน 12 ราย 3.38 ± 0.88 mmol/L & 3.08 ± 0.71 mmol/L กลุ่มที่ 3 Severe hyperlactatemia (> 5 mmol/L) จำนวน 9 ราย 8.44 ± 2.44 mmol/L & 9.65 ± 2.69 mmol/L

Comparison of developed HPLC & Enzymaic assay Pearson correlation; r = 0.93

Comparison of developed HPLC & Enzymaic assay 4.20 4.74 P < 0.05

Comparison of developed HPLC & Enzymaic assay Enzymatic assay Accuracy 99.38% 91.10% Precision 4.76% 6.82% Reagent LOW COST HIGH COST Expire date Long Short

Conclusion Validation of developed HPLC for Lactate ► good accuracy & precision Utility

Acknowledgement กรมควบคุมโรค ภาควิชานิติเวช คณะแพทยศาสตร์ มหาวิทยาลัยเชียงใหม่ หน่วยปฏิบัติการเคมีคลินิก คณะแพทยศาสตร์ มหาวิทยาลัยเชียงใหม่ สถาบันวิจัยวิทยาศาสตร์สุขภาพ มหาวิทยาลัยเชียงใหม่ สำนักงานป้องกันควบคุมโรคที่ 10 เชียงใหม่

Thank you for attention

Sample collection and handling Subject; After overnight fast (12 h) ▼ Blood sample 4 ml (fluoride oxalate tube) relax the hand, unclenching Centrifuge, freez deproteinize

Lactic acid fermentation (animal cell) www.il.mahidol.ac.th/.../L2T1_new.html

HPLC

HPLC Enzymatic Assay 20 15 10 5 T Test (p < 0.01) Lactate (mmol/L)

Samp 7 Samp 9 Samp 4

Samp26 Samp28 Samp 33

%recovery 10 mM Spike1:40 25:1000 5 mM spike 1.25 mM Sample STD 25 ul 400 mM/L 200 mM/L 50 mM/L - D.W. 500 plasma Ac 475

Inter-day Precision (10 days) QC level 2 (4.5-6.74 mM) QC level 1 (1.17-1.75 mM) Spectro HPLC 27 days 10 days 5.12 2.14106(5.73) 1.69 0.595697 (1.40) mean 0.33 0.359 0.05 0.06 SD 6.44 6.26 2.96 2.07 %CV 91.1 101.96% 115.75 95.89% accuracy

Intra-day Precision QC level 2 (4.5-6.74 mM) HPLC spectro. QC level 1 Day 1 (mean) Day 2 (mean) Day 3 (mean) Day 4 (mean) Day 5 (mean) 4.98 5.23 4.92 5.08 4.35 2.092777 (5.59) 2.180323 (5.84) 2.076177 (5.52) 2.160931 (5.78) 2.065659 (5.51) 1.62 1.64 1.66 1.68 0.585947 (1.31) 0.601614 (1.36) 0.584541 (1.31) 0.608000 (1.37) 0.614768 (1.39) 4.91 2.17729 (5.65) 1.65 0.598574(1.35) Mean (5 days) 0.335 (0.152) 0.022 0.013(0.036) SD 6.82 (2.69) 1.33 2.17(2.67) %CV 87.37% 100.53% 113.01% 92.46% accuracy

การใช้สารยับยั้งการสลายตัวของน้ำตาล enzyme Coenzyme or activator Inhibitors Glucose-6-phosphatase Mg++ Citrate Phosphofructokinase Mg++, ADP, AMP, P ATP, Citrate Diphosphofructose phosphatase Mg++, ATP F-, AMP Phosphoglyceraldehyde dehydrogenase DPN+ Iodoacetate Enolase Mg++, Mn++ F-, PPi, Ca++ Pyruvic acid kinase Mg++, K+, fructose 1,6-diphosphate Ca++ Lactic acid dehydrogenase Oxalate นันทยา, อุดมศักดิ์ (2524)

Lactic acid fermentation (animal cell) http://www.sc.chula.ac.th/courseware/bio-u2/ppt/b09.ppt#288,33,ภาพนิ่ง 33

Astles R. et al (1994)

Interference of F and OX Astles R. et al (1994)