Lab : protein chemistry JUN 27th, 2014 Rujira Patanawanitkul, M. D Lab : protein chemistry JUN 27th, 2014 Rujira Patanawanitkul, M.D. chaiyawat suppasilp, M.D. Associate Professor Nednapis Tirawanchai, Ph.D.

วัตถุประสงค์ เพื่อทดสอบกรดอะมิโนและโปรตีนโดยอาศัยคุณสมบัติ ทางเคมีที่จำเพาะ Amino acid Peptides & proteins เพื่อศึกษาคุณสมบัติโปรตีน เช่น การละลาย, Isoelectric point และ การเสียสภาพธรรมชาติ

การทดลองที่ 1 การทดสอบกรดอะมิโนและโปรตีนในสารตัวอย่าง 1.1 การทดสอบ Ninhydrin 1.2 การทดสอบ Biuret

1.1 การทดสอบ Ninhydrin Ninhydrin เป็นสารไม่มีสี ทำปฏิกิริยากับสารที่มีกลุ่ม อะมิโนเสรี ได้เป็นสารสีม่วง free amino group of amino acid or protein ninhydrin amino acid, protein, amine สารที่ให้ผลบวก :

1.1 การทดสอบ Ninhydrin ผลบวกจะได้สารละลายสีม่วง การแปลผล : ผลบวกจะได้สารละลายสีม่วง แต่ถ้าเป็น proline หรือ hydroxyproline (2 o amine) จะได้สารละลายสีเหลือง amino acid “Proline” “ Hydroxyproline” Negative Positive Positive (proline)

Fingerprints: using Ninhydrin

1.1 การทดสอบ Ninhydrin สารตัวอย่าง 15 หยด + Ninhydrin 2 หยด ผสมให้เข้ากัน แล้วแช่ในน้ำเดือด 2 นาที Distilled water Glycine Proline Albumin Globulin ลักษณะของ สารละลาย

(Cu++ in alkaline solution) 1.2 การทดสอบ Biuret น้ำยา biuret ประกอบด้วย Cu++ ในสารละลายที่เป็นด่าง เมื่อทำปฏิกิริยากับสารที่มี peptide bond ในอณู ตั้งแต่ 2 bonds ขึ้นไปจะได้ complex สีม่วง Biuret reagent (Cu++ in alkaline solution) + polypeptide Peptide bond

1.2 การทดสอบ Biuret สารตัวอย่าง 5 หยด + น้ำยา Biuret 1 mL ผสมให้เข้ากัน แล้วสังเกตสีของสารละลาย Distilled water Glycine Proline Albumin Globulin ลักษณะของ สารละลาย

การทดลองที่ 2 - การตกตะกอนโปรตีน โปรตีนเป็นสารที่มีขนาดอณูใหญ่และละลายอยู่ในรูปของ Colloid การละลายของโปรตีนมีความสำคัญและจำเป็นต่อการทำงานของ โปรตีน การละลายของโปรตีนในสารละลายที่เป็นน้ำขึ้นกับปัจจัยหลายชนิด เช่น pH ของสารละลาย, อุณหภูมิ, ประจุสุทธิของโปรตีน หรือ ชนิดของโปรตีนซึ่งจะมีจำนวนหมู่ที่มีความสัมพรรค (affinity) กับน้ำ (เช่น -NH3+, -COO-, -SH, =N+H-, -OH) แตกต่างกัน 10

การทดลองที่ 2 - การตกตะกอนโปรตีน ในการทดลองนี้นักศึกษาจะได้ทดลองเกี่ยวกับปัจจัยต่างๆที่มีผลต่อการละลายของโปรตีน 2.1 การปรับ pH ไปที่ isoelectric point 2.2 การตกตะกอนด้วย ammonium sulfate 2.3 การแข็งเป็นลิ่มด้วยความร้อน 2.4 การตกตะกอนด้วย protein precipitating agents 2.5 การกลับมาละลายได้ใหม่ของโปรตีน 11

การทดลองที่ 2 - การตกตะกอนโปรตีน 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.5 2.5 12

การทดลองที่ 2 - การตกตะกอนโปรตีน 2.1 การปรับ pH ไปที่ isoelectric point ประจุของโปรตีนส่วนใหญ่มาจากสายข้างที่แตกตัวได้ของ amino acid residues และ ปลาย amino/carboxyl group 13

การทดลองที่ 2 - การตกตะกอนโปรตีน 2.1 การปรับ pH ไปที่ isoelectric point ที่ pH = pI (isoelectric point) NET CHARGE = 0 เนื่องจากโปรตีนจะมีประจุสุทธิเป็น 0 ทำให้แรงผลัก (electrostatic) ระหว่างโมเลกุลหมดไป โปรตีนจึงละลายได้น้อยที่สุดและตกตะกอนได้ง่ายที่ pI 14

การทดลองที่ 2 - การตกตะกอนโปรตีน 2.1 การปรับ pH ไปที่ isoelectric point Demonstration ให้สังเกตการตกตะกอนของ casein ที่ pH ต่างๆ 15

การทดลองที่ 2 - การตกตะกอนโปรตีน 2.1 การปรับ pH ไปที่ isoelectric point Demonstration ให้สังเกตการตกตะกอนของ casein ที่ pH ต่างๆ หลอดที่ 1, pH 3.5 หลอดที่ 2, pH 4.1 หลอดที่ 3, pH 4.7 หลอดที่ 4, pH 5.4 หลอดที่ 5, pH 6.0 ผลการทดลอง pI ของ casein คือ ………………… - แสดงว่าสารละลายไม่ขุ่น/ไม่เกิดตะกอน +, ++,+++ แสดงความขุ่นจากน้อยไปมาก x, xx, xxx แสดงปริมาณตะกอนจากน้อยไปมาก 16

การทดลองที่ 2 - การตกตะกอนโปรตีน 2.1 การปรับ pH ไปที่ isoelectric point วิธีการทดสอบ 0.011 M acetic acid 4.5 mL + โปรตีน casein 0.5 mL ผสมให้เข้ากัน (pH ~ 4.7) A ตั้งทิ้งไว้ประมาณ 1 นาที สังเกตผลการทดลอง 1 M NaOH 0.5 mL ผสมให้เข้ากัน (pH ~ 7.5) B ตั้งทิ้งไว้ประมาณ 1 นาที สังเกตผลการทดลอง เปรียบเทียบกับการทดลองที่ 2.3 ตอบคำถามท้ายการทดลองข้อ 3 17

การทดลองที่ 2 - การตกตะกอนโปรตีน 2.2 การตกตะกอนด้วยเกลือ ammonium sulfate (salting out) โปรตีนที่มี hydration shells หนา ละลายน้ำได้ดี ions ของเกลือจะแย่งจับกับน้ำทำให้ hydration shell ของโปรตีนบางลง Adding salts - + + โปรตีนมีโอกาสเข้าใกล้กันมากขึ้นและรวมตัวตกตะกอน - 18

การทดลองที่ 2 - การตกตะกอนโปรตีน 2.2 การตกตะกอนด้วยเกลือ ammonium sulfate (salting out) น้ำละลายไข่ขาว 2 mL + saturated ammonium sulfate 2 mL (100% saturation) A เขย่าให้เข้ากัน สังเกตผลการทดลอง Distilled water 4 mL ปิดปากหลอดด้วย parafilm ผสมให้เข้ากัน B ตั้งทิ้งไว้ 1 นาที และสังเกตผลการทดลอง เปรียบเทียบผลการทดลองกับการทดลองที่ 2.3 ตอบคำถามท้ายการทดลองข้อ 1 19

การทดลองที่ 2 - การตกตะกอนโปรตีน 2.3 การตกตะกอนโปรตีนด้วยความร้อน (heat coagulation) 20

การทดลองที่ 2 - การตกตะกอนโปรตีน 2.3 การตกตะกอนโปรตีนด้วยความร้อน (heat coagulation) HYDROPHOBIC INTERACTION Hydrophobic side chains ส่วนใหญ่จะรวมกันอยู่ ภายในโมเลกุลของโปรตีน ห่างจากสารละลายที่เป็นน้ำ Protein folding 21

การทดลองที่ 2 - การตกตะกอนโปรตีน 2.3 การตกตะกอนโปรตีนด้วยความร้อน (heat coagulation) ELECTROSTATIC INTERACTION HYDROPHOBIC INTERACTION COVALENT BOND HYDROGEN BOND Hydrophilic side chains (polar or charged) ส่วนใหญ่จะอยู่ที่ surface ของโมเลกุลของโปรตีน Protein folding 22

การทดลองที่ 2 - การตกตะกอนโปรตีน 2.3 การตกตะกอนโปรตีนด้วยความร้อน (heat coagulation) 23

การทดลองที่ 2 - การตกตะกอนโปรตีน 2.3 การตกตะกอนโปรตีนด้วยความร้อน (heat coagulation) น้ำละลายไข่ขาว 2 mL + Distilled water 2 mL 10% acetic acid 5 หยด ผสมให้เข้ากัน A นำไปแช่ในน้ำเดือด 5 นาที แล้วตั้งทิ้งไว้ให้เย็น สังเกตผลการทดลอง Distilled water 4 mL ปิดปากหลอดด้วย parafilm ผสมให้เข้ากัน ตั้งทิ้งไว้ 1 นาที B สังเกตผลการทดลอง เปรียบเทียบกับข้อ 2.1 & 2.2 ตะกอนโปรตีนกลับไปละลายใหม่หรือไม่ ตอบคำถามท้ายการทดลองข้อ 2 24

การทดลองที่ 2 - การตกตะกอนโปรตีน 2.4 การตกตะกอนด้วย protein precipitating agents สารบางอย่าง เช่น เกลือของโลหะหนัก (Hg2+, Pb2+, Cu2+) หรือ Alkaloidal reagents สามารถทำให้โปรตีนตกตะกอนได้ โดยเข้าจับกับโปรตีนที่มีประจุตรงข้าม ทำให้โปรตีนตกตะกอน Hg2+ - charged protein + charged acid Protein precipitation 25

การทดลองที่ 2 - การตกตะกอนโปรตีน 2.4 การตกตะกอนด้วย protein precipitating agents วิธีการทดสอบ หยดน้ำละลายไข่ขาว 1 หยดลงบนสไลด์ จำนวน 5 แห่ง หยดน้ำยาต่อไปนี้อย่างละ 1 หยด ลงในน้ำละลายไข่ขาว 1. Saturated mercuric chloride (HgCl2) 2. Saturated picric acid 3. 10% trichloracetic acid 4. 2% tannic acid 5. control (ไม่ต้องหยดน้ำยาใดๆ) 26

การทดลองที่ 2 - การตกตะกอนโปรตีน 2.4 การตกตะกอนด้วย protein precipitating agents สังเกตตะกอน หรือ ความขุ่นโดยดูบนกระดาษสีเข้ม Protein precipitating agents ปริมาณและลักษณะตะกอน Saturated mercuric chloride Saturated picric acid 10% trichloroacetic acid 2% tannic acid +, ++,+++,++++ แสดงความขุ่นจากน้อยไปมาก หรือ ปริมาณตะกอนที่เกิดขึ้น 27