เครื่องมือและเทคนิคพื้นฐานสําหรับห้องปฏิบัติการชีวเคมี อ.พญ.วนัสริน ไมตรีมิตร (พี่ปอ)

ข้อแนะนำการเรียนภาคปฏิบัติวิชาชีวเคมี ตั้งใจฟังคำอธิบาย lab : เนื้อหาสาระสำคัญ และข้อระมัดระวัง ถ้าสงสัยให้ซักถามก่อนทำ lab ( 90% ข้อสอบ lab จะถามในส่วนนี้) ขณะทดลอง: สังเกตผลแล้วบันทึก, ทำความเข้าใจกับผู้ร่วมงาน ถ้าไม่เข้าใจให้ปรึกษาอาจารย์ หรือ เจ้าหน้าที่ประจำห้อง ฝึกทักษะการใช้เครื่องมืออย่างถูกต้อง จำชื่อเครื่องมือที่ใช้บ่อย (สะกดให้ถูก) รู้ข้อดี และข้อจำกัดในการใช้ สามารถอ่านผล คำนวณ และแปลผล ได้อย่างถูกต้อง

ข้อแนะนำการเรียนภาคปฏิบัติวิชาชีวเคมี เข้าเรียนตรงเวลา เวลาเรียนต้องถึง 80 % เคร่งครัดตามคำสั่งประกาศ : การเตรียมตัว และอุปกรณ์สำหรับ ทำการทดลอง ฯลฯ รักษาความสะอาดของเครื่องมือ และสถานที่ Lab safety!!! ใช้เครื่องมือด้วยความระมัดระวัง เพื่อป้องกันอันตรายและความเสียหายของเครื่องมือ

เครื่องมือและเครื่องแก้วในห้องปฏิบัติการชีวเคมี จำชื่อเครื่องมือที่ใช้บ่อย (สะกดให้ถูก) และรู้หน้าที่การใช้งานของเครื่องมือดังกล่าว

เครื่องมือและเครื่องแก้วในห้องปฏิบัติการชีวเคมี Beaker

เครื่องมือและเครื่องแก้วในห้องปฏิบัติการชีวเคมี Erlenmeyer Flask

เครื่องมือและเครื่องแก้วในห้องปฏิบัติการชีวเคมี Graduated cylinder

เครื่องมือและเครื่องแก้วในห้องปฏิบัติการชีวเคมี Volumetric flask

เครื่องมือและเครื่องแก้วในห้องปฏิบัติการชีวเคมี Ostwald-Folin pipette

เครื่องมือและเครื่องแก้วในห้องปฏิบัติการชีวเคมี

การวิเคราะห์ทางชีวเคมี Qualitative (คุณภาพวิเคราะห์) เช่น การวัด pH ด้วยกระดาษวัด pH Quantitative (ปริมาณวิเคราะห์) เช่น ปริมาณระดับน้ำตาล, ระดับโปรตีนใน plasma ฯลฯ เลือกใช้เครื่องมือให้ถูกต้องและเหมาะสมกับการวิเคราะห์

การวิเคราะห์ทางชีวเคมี เครื่องมือที่ใช้วัดปริมาตรและเทคนิคการใช้ pipette or pipet automatic pipette burette or buret volumetric flask

การวิเคราะห์ทางชีวเคมี เครื่องมือที่มีความแม่นยำสูง เหมาะกับวิธีปริมาณวิเคราะห์ Volumetric flask Ostwald-Folin pipette VERY ACCURATE Automatic pipette good for quantitative analysis Burette Serological pipette Graduated cylinder good for qualitative analysis Medicine dropper Erlenmeyer flask Beaker ไม่ควรใช้สำหรับวัดปริมาตร !

เทคนิคการใช้ปิเปต What are pipettes? 1. Volumetric pipette TD (to deliver);ปริมาตรที่ปล่อยออกมาจะเท่ากับที่เครื่องมือกำหนดไว้ TC (to contain);ปริมาตรที่ปล่อยออกมาจะน้อยกว่าที่กำหนด เพราะมีส่วนที่ติดค้างอยู่ภายในของ pipette 1. Volumetric pipette 2. Ostwald-Folin pipette 3. Serological pipette 1 2 3

เทคนิคการใช้ปิเปต

เทคนิคการใช้ปิเปต 1. เลือกปิเปตให้ถูกต้อง ตรวจดูความสะอาดของปิเปต และเลือกปิเปตที่มีสภาพสมบูรณ์ ปลายไม่บิ่น 2. การจับปิเปต ไม่ควรจับใกล้ปลายที่ดูดน้ำยา เนื่องจากอาจเกิดการปนเปื้อนได้

เทคนิคการใช้ปิเปต 3. ต่อลูกยางกับปลายบนของปิเปต บีบลมออกเล็กน้อย ก่อนนำไปจุ่มน้ำยาที่จะดูด สำหรับคนที่ถนัดมือขวา ควรใช้มือขวาถือปิเปต และถือลูกยางด้วยมือซ้าย

เทคนิคการใช้ปิเปต การดูดน้ำยา ไม่ควรจุ่มปิเปตลงไปในน้ำยาให้ลึกหรือตื้นจนเกินไป (ระยะที่เหมาะสม ~ 2-3 cm) 4. ดูดน้ำยาให้เลยขีดวัดปริมาตรที่ต้องการ ~ 1 cm ระวังอย่าให้น้ำยาเข้าลูกยาง ถ้าดูดน้ำยาเข้าลูกยาง ควรเปลี่ยนปิเปตและลูกยางใหม่ น้ำยาที่ดูดเข้าลูกยางต้องทิ้งไป

เทคนิคการใช้ปิเปต 5. ดึงลูกยางออก ใช้ปลายนิ้วชี้ปิดปลายบนของปิเปต

เทคนิคการใช้ปิเปต 6. เช็ดปลายปิเปตด้วยกระดาษซับ เพื่อป้องกันน้ำยาที่อาจติดตามผิวปิเปต ทำให้ปริมาตรที่ต้องการเปลี่ยนไป

เทคนิคการใช้ปิเปต จับปิเปตให้ตั้งฉากกับพื้น ยกให้ขีดอยู่ในระดับสายตา ปรับระดับน้ำยาให้ตรงขีดที่ต้องการ โดยใช้นิ้วชี้กดปลายบนของปิเปต พร้อมกันนั้นก็ใช้นิ้วหัวแม่มือ และนิ้วกลางหมุนก้านปิเปตอย่างช้าๆ เมื่อได้ระดับที่ต้องการแล้ว ให้แตะปลายปิเปตกับขวดน้ำยาเพื่อ remove หยดน้ำยาที่อาจค้างอยู่ที่ปลายปิเปต 7.

เทคนิคการใช้ปิเปต * การดูระดับของน้ำยาให้ดูที่ระดับล่างสุดของ meniscus และให้อยู่ในระดับสายตา

เทคนิคการใช้ปิเปต 8. ปล่อยน้ำยาลงในภาชนะรองรับ โดยถือปิเปตให้ตั้งฉากและให้ปลายปิเปตแตะกับด้านข้างภาชนะ (แต่ต้องไม่จุ่มลงไปในน้ำยาที่มีอยู่)

เทคนิคการใช้ปิเปต 9. แตะปลายไว้กับข้างภาชนะรับ นานประมาณ 2 วินาทีหลังจากที่สารละลายไหลออกจากปิเปตหมดแล้ว 10. สำหรับปิเปตชนิดแตะเป่า (blow-out pipette) ให้เป่าลมเข้าไปไล่น้ำยาหยดสุดท้ายที่ปลายปิเปต ออกมา โดยเป่าสั้นๆ เพียงครั้งเดียว

เทคนิคการใช้ปิเปต ปิเปตชนิดแตะเป่า (blowout) สังเกตได้จากรอยฝ้าหรือรอยขีดเป็นวงรอบโคนซ้อนกันสองวง ปิเปตที่ไม่มีสัญลักษณ์ดังกล่าวเป็นปิเปตชนิด แตะปล่อย ไม่ต้องเป่าน้ำยาหยดสุดท้าย

เทคนิคการใช้ปิเปต 11. หลังจากใช้ปิเปตแล้ว ให้ใส่ปิเปตไว้ในที่แช่ปิเปตทันที เพราะถ้าปล่อยทิ้งไว้ น้ำยาที่ค้างอยู่จะแห้ง ทำให้ปิเปตทำความสะอาดได้ยาก และอาจเกิดการปนเปื้อนขึ้นได้

เทคนิคการใช้ปิเปต

เทคนิคการใช้ปิเปตอัตโนมัติ automatic pipette เหมาะสำหรับดูดสารที่มีปริมาตรน้อยๆ (< 1 mL) เนื่องจากสะดวกและแม่นยำกว่าการใช้ glass pipette Tip ejector button Plunger button Volume adjustment knob Digital volume indicator Tip ejector arm Disposable yellow or blue tip Plastic shaft piston cylinder Pipette tip

เทคนิคการใช้ปิเปตอัตโนมัติ Automatic pipette ขนาด 10 - 100 mL Automatic pipette ขนาด 100 - 1000 mL

เทคนิคการใช้ปิเปตอัตโนมัติ 1. ห้ามปรับปริมาตรเกินขีดต่ำสุด และบนสุด P-100 - 10 to 100 µL P-1000 - 100 to 1000 µL 2. ห้ามจุ่ม pipette ในสารละลาย โดยไม่มี tip สวมที่ปลาย 3. ห้ามเอียง pipette ในระดับขนานกับพื้นขณะที่ยังมีสารอยู่ใน tip

เทคนิคการใช้ปิเปตอัตโนมัติ 1. เลือกขนาดปิเปตให้ตรงกับปริมาตรที่ต้องการวัด ตัวเลขบนปิเปตมีหน่วยเป็น microliter (mL) 2 Volume adjustment dial Digital readout shows the volume you have set.

เทคนิคการใช้ปิเปตอัตโนมัติ 2. ปรับปริมาตรที่ต้องการโดยหมุนที่ปุ่มปรับปริมาตรบนตัว automatic pipette ตัวอย่าง วิธีการอ่านค่าปริมาตรจากปิเปต หลัก พัน ร้อย สิบ ปริมาตร 260 mL Automatic pipette ขนาด 100 - 1000 mL ในห้องปฏิบัติการห้ามนักศึกษาปรับเปลี่ยนปริมาตรเอง แต่ให้ตรวจสอบว่าปริมาตรของปิเปตที่ให้ไว้ ตรงกับที่ต้องการหรือไม่

p 100 p 1000 2 2 2 Volume set: 220 µL Volume set: 22 µL 1000x µL 2 100x µL 10x µL 1x µL 2 2 Volume set: 220 µL Volume set: 22 µL

P-100 57 µL 970 µL

เทคนิคการใช้ปิเปตอัตโนมัติ 3. เลือก pipette tip ให้ตรงขนาดของปิเปต โดยสวมเข้ากับปลายของ automatic pipette (อย่าให้หลวมหรือแน่นจนเกินไป) Tip สำหรับ automatic pipette ขนาด 10 - 100 mL (สีเหลือง) ขนาด 100 - 1000 mL (สีฟ้า) ห้ามดูดสารละลายด้วย automatic pipette โดยไม่ใช้ pipette tip !!! ห้ามจับหรือทำให้ pipette tip ปนเปื้อนระหว่างการใช้

เทคนิคการใช้ปิเปตอัตโนมัติ 4. การดูดและปล่อยน้ำยา 4.1 วิธีการดูดน้ำยา 1 1 2 จังหวะที่ 1 กด plunger เพื่อทำให้เกิดภาวะสูญญากาศในปิเปต* ระดับที่กดมีอยู่สองระดับ (สามารถรู้สึกได้จากการต้านทานต่อการกด) ใช้ระดับแรกเพื่อดูดหรือปล่อยสารละลาย ตามปริมาตรที่ต้องการ แล้วปล่อย plunger ออก

เทคนิคการใช้ปิเปตอัตโนมัติ 4.2 วิธีการปล่อยน้ำยา 1 2 1 2 จังหวะที่ 1 แตะปลาย tip กับภาชนะรับ แล้วกด plunger ไปจนถึงระดับที่ 1 จะทำให้น้ำยาจาก pipette tip ไหลลงสู่ภาชนะรับ จังหวะที่ 2 รอเป็นเวลา 1-2 วินาที ก่อนที่จะกด plunger ลงไปจนสุด (ระดับที่ 2) ซึ่งจะเป็นการไล่น้ำยาที่เหลืออยู่ใน pipette tip ลงสู่ภาชนะรับจนหมด (คล้ายกับปิเปตชนิดแตะเป่า)

เทคนิคการใช้ปิเปตอัตโนมัติ -แตะปลาย tip ที่ผนังข้างภาชนะที่รองรับ (tube) ค่อยๆกด plunger ลงไปถึงระดับต้านทานแรก รอสารละลายไหลออกจาก tip 1-2 วินาที แล้วกด plunger จนสุดเพื่อไล่สารละลายออกจาก tip

เทคนิคการใช้ปิเปตอัตโนมัติ 5. หลังจากปล่อยน้ำยาแล้ว กด plunger ค้างไว้ พร้อมดึง pipette ออกจากภาชนะ แล้วค่อยๆปล่อย plunger ให้คืนสู่ตำแหน่งเดิม ปลด tip ออกจาก pipette ลงสู่ภาชนะรองรับ ด้วยการ กดปุ่ม ejector

เทคนิคการใช้ปิเปตอัตโนมัติ วิธีการปล่อยน้ำยา autopipet plunger.MPG

เทคนิคการใช้ปิเปตอัตโนมัติ 4.3 วิธีการจุ่มน้ำยา * จับ pipette ให้ตั้งฉากกับพื้น * จุ่มให้ปลาย tip อยู่ต่ำกว่าระดับผิวเพียง~2-3 mm ค่อยๆ ปล่อย plunger จากระดับที่ 1 กลับคืนสู่ตำแหน่งเดิม โดยค้างปลาย tip ไว้ประมาณ 3 วินาที (ขึ้นอยู่กับความหนืดของสาร)

ข้อควรระวังในการใช้ปิเปตอัตโนมัติ 1. ถ้าดูดน้ำยาและพบว่ามีฟองอากาศปนเข้ามา ให้ ปิเปตซ้ำใหม่ 2. ปล่อย plunger อย่างรวดเร็วอาจทำให้น้ำยาถูกดูดเข้าสู่ตัว pipette ทำให้เกิดความเสียหายและเกิดการปนเปื้อนได้

เทคนิคการใช้ปิเปตอัตโนมัติ

เทคนิคการใช้ burette 1. burette with stopcock 2. burette with clamp 1 2

เทคนิคการใช้ burette 1. ใช้ funnel ในการรินน้ำยาลงไปในบูเร็ต ให้เลยขีดวัดปริมาตรที่ต้องการ ~ 1 cm - รินน้ำยาด้วยความระมัดระวัง ไม่ให้น้ำยาไหลล้นออกมาจากบูเร็ต

เทคนิคการใช้ burette 2. เอา funnel ออก รอสักครู่ แล้วปรับระดับน้ำยาให้อยู่ในระดับปริมาตรที่ต้องการ โดยไขน้ำยาส่วนเกินลงใน waste container ที่เตรียมไว้โดยเฉพาะ เมื่อได้ระดับของน้ำยาที่ต้องการแล้ว ให้แตะปลายบูเร็ตกับ container เพื่อ remove หยดน้ำยาที่ค้างอยู่ที่ปลายบูเร็ต

เทคนิคการใช้ burette 3. ไขน้ำยาตามปริมาตรที่ต้องการลงในภาชนะรับ การใช้บูเร็ตเพื่อตวงน้ำยา

เทคนิคการใช้ burette 4. เมื่อได้ปริมาตรที่ต้องการ ให้แตะภาชนะรับกับปลายบูเร็ต เพื่อให้ได้ปริมาตรของน้ำยาครบถ้วน

เทคนิคการใช้ burette

เทคนิคการใช้ burette การใช้ burette ในการไตเตรต (titration)

เทคนิคการใช้ volumetric flask เป็น volumetric glassware ที่มีความแม่นยำสูง มีหลายขนาด แต่ละขนาดจะมีขีดบอกปริมาตรขีดเดียวที่คอขวด ซึ่งเมื่อเติมน้ำหรือสารละลายถึงขีดดังกล่าว จะได้ปริมาตรที่กำหนดไว้ ใช้เตรียมหรือเจือจางสารละลาย

เทคนิคการใช้ volumetric flask ใส่สารที่ต้องการละลาย (อาจจะเป็น solid หรือ liquid) ลงไปใน flask เติมน้ำกลั่นประมาณ 1/2 หรือ 2/3 ของ volumetric flask ผสมให้เข้ากัน เติมน้ำกลั่นจนถึงขีดบอกปริมาตรบน flask ปิดปาก flask ด้วย parafilm และผสมให้เข้ากัน (inverting) * จับ flask บริเวณที่คอและก้น ไม่จับที่คอที่เดียวเนื่องจากอาจเกิดการเสียหายได้

การใช้ medicine dropper ใช้สำหรับดูดและปล่อยน้ำยาที่ไม่ต้องการความแม่นยำ (น้ำยาจำนวน 15 หยด จะมีปริมาตรประมาณ 1 mL) เลือกใช้ dropper ที่ปลายอยู่ในสภาพดี (ไม่บิ่นหรือหัก) เพื่อให้การไหลและปริมาตรของหยดน้ำยาสม่ำเสมอ การดูด ต้องระวังไม่ให้น้ำยาเข้ามาในลูกยาง เนื่องจากจะทำให้ลูกยางแดงเสื่อมสภาพหรือ เกิดการปนเปื้อนจากสิ่งสกปรกในลูกยางลงสู่น้ำยา ถ้าเกิดกรณีดังกล่าว ควรแจ้งเจ้าหน้าที่ เพื่อขอเปลี่ยนใหม่

การใช้ medicine dropper หยดน้ำยาให้ลงกลางภาชนะรับ อย่าให้ติดข้างภาชนะ เพราะอาจทำให้ปริมาตรของน้ำยาผิดไป ถ้าไม่ได้เขย่าผสมน้ำยาในภาชนะให้เข้ากัน

Care and use of glasswares หลังจากทำความสะอาดเครื่องแก้วแล้ว ให้ rinse ด้วยน้ำกลั่น Be conscientious!

LAB EXERCISES 1. ใช้ Ostwald-Folin pipette ดูดน้ำกลั่น ปริมาตร 2 mL จากขวดใส่ในหลอดทดลอง (ขนาด 18x150 mm) 2. ใช้ serological pipette ดูดน้ำกลั่น ปริมาตร 4 mL จากขวดใส่ในหลอดทดลอง (ขนาด 18x150 mm) 3. ใช้ automatic pipette ดูดน้ำยา A ปริมาตร 80 mL ใส่ในหลอดทดลองจากข้อ 1 4. ใช้ automatic pipette ดูดน้ำยา A ปริมาตร 750 mL ใส่ในหลอดทดลองจากข้อ 2 5. เตรียมสารละลายเจือจางของน้ำยา A ในน้ำกลั่นที่ dilution 1:25 เพื่อนำไปใช้ในวิธีปริมาณวิเคราะห์ (quantitative analysis) 6. เติมน้ำกลั่นลงใน burette และ ทำการตวงน้ำกลั่นจาก burette ปริมาตร 3 mL ลงในหลอดทดลอง (ขนาด 18 x 150 mm) 7. เติมน้ำยา A ปริมาณ 15 หยด โดยใช้ medicine dropper ลงในหลอดทดลอง

Demonstration videos http://www.si.mahidol.ac.th/department/Biochemistry/home/MD_courseware.htm

Demonstration videos คอมพิวเตอร์ประจำโต๊ะ > D: > Self directed Learning > Biochemistry > Clips

Item check list

ตั้งใจทำ LAB จ้า