104203 : Mutation 04/04/60 รศ.ดร.กรกช อินทราพิเชฐ

Mutation & Rapair

Mutation การเปลี่ยนโครงสร้างของ Genes ทำให้เกิด genes รูปแบบใหม่ (Alternative forms) เป็นคุณลักษณะอย่างหนึ่งของ genes ที่เปลี่ยนแปลงได้ ผล - เปลี่ยน Phenotype หรือไม่เปลี่ยน - เกิด Biodiversity - ใช้ศึกษา การควบคุมพันธุกรรม

Types of Mutation ใน Molecular Genetics I. Mutation ระดับ DNA sequence II. Mutation ระดับ Gene III. Reversion Effect ของ Mutation

I. Mutation ระดับ DNA sequence 1. Point Mutation 2. Insertion 3. Deletion 4. Inversion II. Mutation ระดับ Gene 1. Silent mutation 2. Missense mutation 3. Nonsense mutation 4. Frameshift mutation III. Reversion Effect ของ Mutation 1 Back mutation 2. Second site reversion 3. Suppression

I. Mutation ระดับลำดับDNA (DNA sequence)

Bases ใน Nucleic Acids

CH3

1. Point Mutations mutation โดยแทนที่ 1 nucleotide ด้วยอีก nucleotide อาจเป็นได้ทั้ง Transition คือ แทนที่ระหว่าง base กลุ่มเดียวกัน purine to purine (A --> G) หรือ pyrimidine to pyrimidine (T--> C) Transversion คือ แทนที่ระหว่าง base ต่างกลุ่ม purine to pyrimidine (A --> T) pyrimidine to purine (G --> C)

Point mutation

2. Insertion Insertion คือ การสเพิ่ม base pair ใน DNA

3. Deletion Deletion คือ การเอา base pair ออกจาก DNA

4. Inversion เป็นการตัดส่วนของ DNA duplex แล้วแทรกใส่เข้าไปอีกครั้งในตำแหน่งเดิมแต่สลับทิศทาง

Mutation ทำให้เปลี่ยนแปลงที่ DNA sequence Point mutation Insertion / Deletion Inversion

II. Mutation ระดับ Gene Mutation เกิดใน Intergenic region ไม่แสดง effect Mutation เกิดใน Coding region แสดง effect

1. Silent mutation เมื่อเกิด point mutation ในตำแหน่งที่ 3 ของ codon เนื่องจากความไม่คงที่ (wobble) ของ genetic code ทำให้ไม่มีผลเปลี่ยน amino acid sequence ของ gene product --> ไม่ให้ mutant phenotype Mutation ภายใน intron

Silent Mutation

2. Missense mutation เป็น Point mutation 1 base แล้วเป็นผลให้เปลี่ยน codon --> เปลี่ยน amino acid ส่วนมากเกิดกับ ตำแหน่งที่ 2 หรือ 3 ของ cocdon ส่วนน้อยที่เกิดกับตำแหน่งที่ 3 (wobble) ทำให้เปลี่ยนเป็น mutant phenotype ขึ้นกับ amino acid sequence

Missense Mutation

3. Nonsense mutation Point mutation ที่เปลี่ยน codon ปกติให้เป็น stop codon ทำให้ gene กุด (truncated gene) --> polypepttide สูญเสียส่วนปลาย carboxyl ซึ่งอาจเป็นส่วนจำเป็นของ protein ก็ได้ ผลเปลี่ยนเป็น mutant phenotype

Nonsense Mutation

4. Frameshift mutation เป็น Insertion หรือ deletion หลาย base pairs แล้ว ทำให้ชุดของ codon (reading frame) ส่วนหลังของ mutation เป็นต้นไปเปลี่ยน ผลเปลี่ยนเป็น mutant phenotype

Frameshift Mutation

III. Reversion Effect ของ Mutation

III. Reversion Effect ของ Mutation Mutant ที่ กลับไปเป็น wild-type phenotype เพราะ Second mutation Second mutation ทำให้ restore nucleotide sequence ดั้งเดิม ของ DNA Back mutation โดย point, insertion และ deletion mutation Second site mutation (Forward mutation) Suppression mutation

1. Back mutation

2. Second site mutation Mutation อันที่ 2 ใน gene เดิมที่ restore original phenotype แต่ไม่ restore original DNA sequence เช่น Mutation อันที่1 เกิด missense mutation ที่ DNA Mutation อันที่ 2 เกิดที่ codon เดียวกับ missense mutation ที่ mRNA --> ได้ gene product เหมือน origin แต่ DNA sequence ไม่เหมือนเดิม

3. Suppression mutation Mutation อันที่ 2 ในต่าง gene เกิดกับ anticodon เพื่อไป reverse หรือ suppress stop codon mutant (nonsenese mutation)

Suppression mutation

สาเหตุของ mutation

Causes of Mutations 1. Spontaneous Mutations 2. Chemical Mutations 3. Radiation-induced Mutations Mutagens คือ chemical agents หรือ physical agents ที่ทำให้เกิด mutation Mutagenesis คือ การเกิด mutation

1. Spontaneous Mutation

1. Spontaneous Mutation mutation เกิดเอง ระหว่าง replication ใน bacterial cell เกิดทุก ๆ 1 cell ใน 108 cell divisions ในคน rate ยิ่งสูงกว่า มักเกิดอย่าง random โดยเป็นความบกพร่องของ DNA replication ที่เล็ดลอด proofreading function ของ replicating enzymes Spontaneous mutation เกิดจากหลายสาเหตุ Replication mechinary Tautomeric shift ของ Base Frameshift ระหว่าง replication

1.1 Replication machinery E.coli mutant strains มี unfaithful replication เรียกว่า Mutators Gene ของ DNA Polymerase encode ให้ mutant subunits --> mismatch repair และ proofreading ไม่ได้ใน replication Rate mutation ของ mutator สูงกว่าปกติและ mutator ปรับตัวต่อ environment ได้ดี

1.2 Tautomeric shift ของ base Base ที่เป็นส่วนประกอบใน DNA มีได้ 2 form/Tautomer Tautomers คือ structural isomer ที่มี สูตรโครงสร้าง้หมือนกัน แต่ โครงสร้างโมเลกุลต่างกัน แต่ปกติ ใน DNA แต่ละ base มี form เดียว การเปลี่ยน form ของ base เรียกว่า Tautomerization หรือ Tautomeric shift Purine Pyrimidine A amino --> imino T keto --> enol G keto --> enol C amino --> imino

Common Rare

Tautomers ของ Base ใน DNA Base pairing Base pairing ปกติ ไม่ปกติ T keto = A amino T enol G keto T keto G enol C amino G keto C imino = A amino C amino = A imino

กลไกการเกิด mutation จาก tautomers

1.3 Frameshift mutation ระหว่าง DNA replication มี insertion/deletion ทำให้ reading frame ของ codons เปลี่ยนตั้งแต่จุดเกิด mutation ได้ mutant protein

Frameshift mutation

2. Chemical - Induced Mutation

2. Chemical Mutagenesis Mutation โดย chemicals และ radiation เกิดบ่อยกว่า spontaneous mutation Chemicals บางอย่างเร่งอัตรา mutation หรือ induced mutation Chemicals นั้นเรียกว่า Mutagens Chemical mutagens 2 กลุ่มใหญ่ Mutagenic ต่อ replicating DNA Mutagenic ต่อ replicating และ nonreplicating DNA Chemical mutagens ที่มีประสิทธิภาพ (potent) 5 กลุ่ม

Chemical Name Common Name I. Alkylating agents Di-(2-chloroethyl) sulfide Mustard gas or sulfur mustard Di-(2-chloroethyl) methylamine Nitrogen mustard Ethylmethane sulfonate EMS Ethylethane sulfonate EES II. Base analogs 5-Bromouracil 5-BU 2-Aminopurine 2-AP III. Acridines 2,8-Diamino acrdine Proflavin IV. Deaminating agents Nitrous acid - V. Hydroxylating agent Hydroxylamine HA

I. Alkylation การใส่ Methyl [CH3] หรือ Ethyl [CH2] groups เข้าที่ base ของ DNA ทำให้เปลี่ยน base pairing Alkylation ส่วนมากเกิดกับ Adenine : ถูกใส่ alkyl group ที่ N3 ของ base Guanine : ถูกใส่ alkyl group ที่ N7 ของ base

Alkylation

II. Base Analog Base analog มี โครงสร้างคล้าย normal base และ ใส่เข้า DNA ได้ เช่น 5-bromouracil [BU] และ 2-aminopurine [AP] ทำให้ mispairing และ เกิด mutation ระหว่าง replication

Base analog

III. Intercalation Positively charged molecules สอดแทรกโมเลกุลเข้าในโมเลกุล DNA ระหว่างชั้นของ base pairs ของ DNA Proflavin, Acridine orange, Ethidium bromide และ related compounds ทำให้ DNA แข็ง, เปลี่ยนรูปแบบ (conformation) และงอ Acridine-induced mutation ระหว่าง replication โดย insertion หรือ deletion 1 - 3 base pairs --> frameshift --> gene product ที่ไม่ function

IV. Hydroxylation Hydroxylamine (NH2OH) ทำให้เกิด transition G : C --> A : T Amino group ของ Cytosine [C] ถูก hydroxylated --> ได้ Hydroxylamine-C ทำ base pair กับ Adenine [A] แล้วทำให้ transition จาก G : C --> A : T Revert mutation นี้ได้ด้วย Nitrous acid หรือ base analog

Hydroxylation

3. Radiation - Induced Mutation

3. Radiation-induced Mutation รังสี ที่คลื่นยิ่งสั้นยิ่งมีพลังงานสูงกว่า visible light Radiation แบ่งเป็น Inonizing radiation : X-ray, gamma ray, cosmic ray Nonionizing radiation : ultraviolet light

Spectrum ของแสง

Ionizing radiation High energy ทะลุเนื้อเยื่อในระยะทางพอสมควร ใช้ประโยชน์ทางการแพทย์ การวิจัย และ nuclear reactor high energy กระทบ atoms เช่น H2O ทำให้ atoms ปล่อย electrons ออก -> atom กลายเป็น positively charged free radicals หรือ ions ionize H2O รอบ ๆ DNA ได้ free radicals โดยเฉพาะ free radical ที่มี O- จะ reactive มาก Ions เหล่านี้ชนโมเลกุลอื่นๆ --> ปล่อย electrons เพิ่มขึ้น --> ions เพิ่มขึ้น

ความรุนแรงแล้วแต่สิ่งมีชีวิต และปริมาณ ทำให้เกิด --> point mutation ถึงเปลี่ยน chromosome structure base change single strand break double stand break และ chromosome break ซึ่งจะถูกเก็บและ repair ยาก ionizing radiation จึงเป็นทั้ง mutagen และเป็น clastogen X rays, alpha rays, beta rays, gamma rays, และ cosmic rays

Nonionizing radiation Low energy กว่า ionizing radiation เช่น ultraviolet rays ทะลุเฉพาะเซลล์ชั้นบน เช่น ผิวหนัง --> skin cancer UV ส่งพลังงานให้ electrons ที่ ชั้นนอก --> electron excitation --> atom มีพลังงานเพิ่ม --> ทำลาย DNA UV ทำให้ pyrimidine bases ที่อยู่ติดกันบน DNA strand เดียวกัน เชื่อมต่อกัน ได้ dimers ของ 2 bases ส่วนมากเกิดระหว่าง T กับ T ได้ T-T dimer

104203 : Mutation 04/04/60 DNA pol. Enzyme ใส่ base คู่กับ T=T ไม่ได้ หรือใส่ base อย่าง random เป็นผลให้เกิด mutation หลัง replication รศ.ดร.กรกช อินทราพิเชฐ

รูปแบบของ DNA mutation โดย UV ที่ศึกษาพบแล้ว

4. Heat เป็น environmental mutagen ที่สำคัญที่สุด Heat ตัด bond ระหว่าง purine กับ sugar ได้ apurinic siteได้ถึง 10,000 sites ต่อ 1 cell ต่อวัน ในคน

DNA Repair