2. ปฏิกิริยาระหว่างแอนติเจนและแอนติบอดี ปฏิบัติการที่ 2 1. การทำให้เจือจาง (Serial dilution) 2. ปฏิกิริยาระหว่างแอนติเจนและแอนติบอดี

การทำให้เจือจาง (Serial dilution) 0.5 ml น้ำสี 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 1 2 3 4 5 6 น้ำกลั่น0.5 ml Dilution 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 control

การคำนวณ Dilution N1V1 = N2V2 N1 = dilution ของสารที่ดูดมา (V2 = V1 + ปริมาตรของน้ำในหลอดที่คำนวณ)

N2 = N1 x V1 V2 N2 = 1/4 x 1/2 =1/8 1 V1 V2 = 0.5+0.5 =1 1:4 ? N1 N2 0.5 ml N2 = 1/4 x 1/2 =1/8 1 2 3 V2 = 0.5+0.5 =1 น้ำกลั่น 0.5 ml 1:4 ? N1 N2

การทดลองที่ 1. Tube precipitation test ดูสาธิต - ตามที่ตั้งแสดงไว้ที่บริเวณริมหน้าต่าง หรือโต๊ะกลาง ตอบคำถามว่า Ab titer มีค่าเท่ากับเท่าไร

Dilution 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 control Serum 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 1 2 3 4 5 6 Diluent0.5 ml Dilution 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 control Antigen 1 1 1 1 1 1 หยด

Ab Titer = 1:8 or 8 ตะกอน (precipitate) Dilution 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 control ตะกอน (precipitate) Ab Titer = 1:8 or 8

การทดลองที่ 2 Immunodiffusion 1 2 3 4 5 6 7 Ag1 Ag2 Ag3 Ab -ให้ฝึกหัดหยอดสาร Ag และ Ab ลงในช่องต่าง ๆ ตามที่กำหนด -ดู precipitin band ที่เกิดขึ้น (ให้อาจารย์แสดงให้ดู)

การทดลองที่ 3. Blood grouping - ให้ น.ศ. จับคู่กันเจาะเลือดจากปลายนิ้ว เพื่อทำการตรวจหมู่เลือด - ใช้ sterile technique ป้องกันการติดเชื้อ - เช็ดสำลี-แอลกอฮอล์, ใช้ lancet จิ้มนิ้ว, หยดเลือดบน slide 2 หยด - ทิ้งอุปกรณ์ต่าง ๆ ที่ใช้แล้วลงในถังที่จัดไว้ให้

เลือดจากปลายนิ้ว Anti-A Anti-B Agglutination

ไม่เกิด Agglutination

การสาธิต 1. Single radial immunodiffusion (SRID) 2. Immunoelectrophoresis (IEP) 3. Immunodiffusion (ID) 4. Tube precipitation 5. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) By... Assistance Professor Suwin Wongwajana,MD.

Microtiter Plate (ELISA Plate) 96 wells plate (8 rows, 12 columns)

Indirect ELISA (For detection of antibody) 1. Coat plate with Antigen

2. Wash

(Y) Y Y 3. Add specimens (with Ab, or No Ab) with specific Ab No specific Ab Y Y Y

4. Wash with specific Ab (Y) No specific Ab Y

4. Add conjugate (anti-human IgG=Enzyme)

5. Wash (Y) with specific Ab No specific Ab Y E

Y = Ag Human-IgG immunized Y Y Y Rabbit anti-human IgG

6. Add substrate (Chromogenic) Y E E E Y E Y E Y

Y E

ความเข้มข้นของสีจะผันแปรกับปริมาณspecific antibody ในสิ่งส่งตรวจ วัดค่า Absorbance (O.D.) ความเข้มข้นของสีจะผันแปรกับปริมาณspecific antibody ในสิ่งส่งตรวจ

Immunofluorescence(IF) Cell Tissue

Direct Immunofluorescence (For detection of antigen) CD4 CD3

Anti-CD4 = Fluorescein dye + F* F* F* F* CD4 CD3 F* F*

Fluorescent Microscope CD4+ve Fluorescent Microscope

CD4 CD8 CD4 CD8 CD4 CD8 CD4 CD8

Indirect Immunofluorescence (For detection of antigen) Conjugate F* F* Specific Ab

F* Mouse anti-rabbit = F* F* F* Rabbit anti-CA Ag CA Ag

สิ่งที่ น.ศ. ต้องทำ 1. ฝึกทำ serial dilution 2. ตรวจหาหมู่เลือดของตัวเองโดยจับคู่กันทำ 3. หัดหยอดหลุม slide immunodiffusion 4. ดูสาธิตที่ตั้งแสดงไว้ที่บริเวณริมหน้าต่าง หรือโต๊ะกลาง 5. Conference วันศุกร์ที่ 22 มิ.ย.50 8.00-9.00 น. มี Quiz