Detection of diatom in formalin-fixed tissue by proteinase K digestion presented by Mr. Banyud Yimchang Student Code: 51312313 SEMINAR IN FORENSIC SCIENCE II Code: 510702

ABSTRACT. การตรวจหา Diatom มีการศึกษาในกรณีที่มีการจมน้ำตาย ด้วยการย่อยของ Enzyme Proteinase K โดยการใช้ Formalin ช่วยในการรักษาสภาพของเนื้อเยื่อปอด ซึ่ง Formalin เป็นตัวช่วยอีกทางหนึ่ง ที่สามารถลดการติดเชื้อที่ก่อให้เกิดโรค นอกจากนี้ยังศึกษาผลกระทบของ Hydrogen peroxide โดยที่เนื้อเยื่อถูก Fixed ด้วย Formalin ที่ความเข้มขึ้น 0.01 โมล มี Tris-HCL (pH7.5) มีส่วนประกอบของ Sodium dodecyl sulfate (SDS) (สารที่ทำให้เป็นกลางไม่ให้เนื้อเยื่อเกิดการย่อยสลาย) อาจจะมีหรือไม่มี Glycine ที่เวลา 6 และ 12 ชั่วโมง ที่อุณหภูมิ 80 องศา ใน Incubator แล้วนำไปตรวจวิเคราะห์ไดอะตอมทั้งเชิงปริมาณและเชิงคุณภาพ

Diatoms ? (Kingdom Protista) (Divition Bacillariophyceae) Introduction. Diatoms ? (Kingdom Protista) (Divition Bacillariophyceae) เป็นกลุ่ม monophyletic, single cell, Photosynthetic มีลักษณะตามผนังเซลล์ที่ไม่ซ้ำกันของซิลิกา, Frustule เป็น 2 ส่วน - เหมือนจานและฝาที่ทับซ้อนกัน - มีเซลล์ที่อยู่ภายใน Ex. Chloroplasts… Coscinodiscus. Asterionella. Cymatopleura.

Frustule –ส่วนที่ 1 (Epitheca) ส่วนบน –ส่วนที่ 2 (Hypotheca) ส่วนล่าง Introduction. Structure of diatom. Frustule –ส่วนที่ 1 (Epitheca) ส่วนบน –ส่วนที่ 2 (Hypotheca) ส่วนล่าง Centrate Pennate ภาพชิ้นส่วนทั้งสอง Frustule

Introduction. Diatoms Diatoms centrate. - Centrobacillariophyceae เป็นปกติ radially สมมาตร เช่น Melosira. Diatom pennate. - Pennatibacillariophyceae แสดงสมมาตรสองข้าง เช่น Pinnularia.

Introduction.

Introduction.

2.Materials and methods. 2.1 ใช้ตัวอย่างของเนื้อปอดที่ Unfixed หรือ Fixed-formalin ใน 6 กรณีของการจมน้ำตาย ตารางที่ 1 กรณีการจมน้ำตาย Case Age Sex Body hight(cm) Body weight(kg) Lung weight PIM Left (g) Right (g) 1 48 M 182 100 540 581 0.5-1M 2 42 168.5 71 549 651 2-4 D 3 84 F 145.5 35 436 421 1.5-2 D 4 61 155.5 410 501 3-5 D 5 28 172.3 75 532 566 1-2 W 6 70 58.5 539 793 1.5-3 D PIM : ช่วงระยะเวลาของการตาย

10 g block of formalin-fixed lung tissue. 2.2 Enzymatic digestion of fixed or unfixed tissue. 10 g block of formalin-fixed lung tissue. The sample was heated at 100°C in 100 ml of 0.01 M Tris–HCl buffer (pH7.5) containing 2% SDS (tissue lysis-buffer), with or without 0.2 M glycine for 6 h. Sample added to 500 ml of 10 mg/ml proteinase K and shaken gently at 50 °C overnight.

100 ml. of distilled waterwas added and Thereafter, 500 ml. of proteinase K solution and 100 ml. of distilled waterwas added and incubated at 50 °C with gentle shaking overnight. Sample was centrifuged at 3000 rpm. for 15 min, and the upper layer was removed. NOTE. For enzymatic digestion of unfixed lung, 10 g. of tissue was minced, mixed with tissue lysis-buffer and 500 ml. of 10 mg/ml proteinase K, and subsequently processed as heated formalin-fixed lung tissue.

6 Hour. 12 Hour. 2.3 Effect of hydrogen peroxide on contamination and Diatoms. Sediment was incubated with two volumes of hydrogen peroxide at 80°C 6 Hour. 12 Hour. Centrifuged at 3000 rpm. for 15 min, and the upper layer was removed. Sediment with or without incubation with hydrogenperoxidewas transferred on to a coverglass, mounted in Mountmedia. Examined under a light microscope equipped with an objective (200).

2.4 Comparison of the number and proportion of diatoms between fixed and unfixed lung. ตารางที่ 2 แสดงการวิเคราะห์ปริมาณของ Diatom ในเนื้อปอดที่ Formalin fixed และ Unfixed Case Fomaline–fixed lung Unfixed lung Centric Pennate 1. 711 (73%) 270 (28%) 228 (66%) 166 (34%) 2. 495 (69%) 221 (31%) 986 (65%) 526 (35%) 3. 20 (18%) 91 (82%) 11 (10%) 95 (90%) 4. 13 (44%) 17 (56%) 8 (31%) 17 (69%) 5. 5 (10%) 40 (90%) 3 (6%) 52 (94%) 6. 25 (3%) 787 (97%) 41 (3%) 1492 (97%)

3. Results 3.1 Enzymatic digestion of fixed lung in tissue lysis-buffer, with or without glycine เนื้อเยื่อ Fomalin–fixed ที่มี Glycine buffer ละลายอยู่ (A) ในขณะที่ส่วนใหญ่เนื้อเยื่อ Fomalin–fixed ไม่มี Glycine (B)

3.2. Effect of hydrogen peroxide on the contamination and diatoms.

(รูปที่ 2B ) บ่มด้วย Hydrogen peroxide นาน 6 ชั่วโมง วัตถุและสิ่งแปลกปลอมจะเปลี่ยนไม่มี จึงทำให้สามารถเห็นขอบเขตขอ Diatom ชัดเจนขึ้น

ที่ได้รับความเสียหายจากการบ่มที่ใช้เวลา 12 ชั่วโมง (รูปที่ 2 C) Diatom บ่มด้วย Hydrogen peroxide ที่ได้รับความเสียหายจากการบ่มที่ใช้เวลา 12 ชั่วโมง

(รูปที่ 2B ) (รูปที่ 2A ) (รูปที่ 2C ) 3.3 Comparison of the number and proportion of the diatoms between fixed and unfixed lung. (รูปที่ 2B ) (รูปที่ 2A ) (รูปที่ 2C )

4.Discussion จากการอ้างอิงผลการศึกษาแสดงให้เห็นถึงค่าของโปรตีนจาก Electrophoresis หรือ GC/MS ที่สามารถแสดงการย้อนกลับของเนื้อเยื่อ FFPE ที่ให้ความร้อนใน Buffer ที่มี SDS ที่มีหรือไม่มี Glycine 2. เศษชิ้นส่วนของเนื้อเยื่อที่ Formalin – fixed ยังคงเหลือใน Buffer ที่ไม่มี Glycine. เนื้อเยื่อ Formalin - fixed พบว่ายังมี Formaldehyde หลงเหลืออยู่ ถึงจะล้างใน Buffer หากว่า Formaldehyde ยังไม่คงอยู่ในเนื้อเยื่อ FFPE

แสดงการย้อนกลับได้ของ Glycine ใน การย้อยด้วย enzyme proteinase K ของ Formalin fixed tissue. Formalin ส่วนที่หลวงเหลืออยู่จะยัง proteinase K และฟอร์มโครงกับโปรตีนที่แปลงสภาพแล้ว โดย SDS. ส่วนไกลซีน ใน buffer จะป้องกันการถูกยับยังของ proteinase K และการคืนกลับโครงข่ายของโปรตีน โดยกลุ่ม Formyl ของ Formadehyde

5.Conclusion ผลของการศึกษานี้แนะนำตรวจหา Diatom กับการย่อยด้วย Proteinase K สามารถแสดงให้เห็นในเนื้อเยื่อ Formalin-fixed โดยการให้ความร้อนแก่ตัวอย่าง Buffer ที่มี Glycine การศึกษานี้แนะนำให้ใช้เนื้อเยื่อ Formalin-fixed มากกว่าเนื้อเยื่อ Unfixed สำหรับการตรวจหา Diatom ในรายที่มีความเสี่ยงต่อการติดเชื้อ นอกจากนั้น การบ่มการย่อยด้วย Hydrogen peroxide ในเวลาที่จำกัด สามารถช่วยในการตรวจวิเคราะห์หา Diatom ทั้งปริมาณและคุณภาพในตัวอย่างของปอดที่มีสิ่งแปลกปลอมปนเปื้อนในการสูดดมในรายที่จมน้ำหรือภายใต้สภาวะอื่นๆ

Thank you.