โครงการการใช้ดีเอ็นเอกำกับลักษณะพันธุ์ไม้ไทย : เรื่องการศึกษาความหลากหลายพันธุกรรมฝรั่งพื้นบ้านและพันธุ์การค้า

1. เตรียม DNA จากใบพืช ดีเอ็นเอ

2. เพิ่มปริมาณ DNA ในหลอดทดลองโดยเทคนิควิธี RAPD และ AFLP โดยปฎิกิริยา PCR (Polymerase Chain Reaction)

เทคนิค AFLP เทคนิค RAPD ดีเอ็นเอ เทคนิค AFLP เทคนิค RAPD DNA Denture 91.50C, 1 min. PCR 1 20 รอบ ตัดดีเอ็นเอพืชด้วยเอนไซมส์ในตำแหน่งจำเพาะเกก่อนแล้วจึง ใช้ดีเอ็นเอสายสั้นมาสุ่มเข้าคู่ ก่อนเพิ่มปริมาณปฏิกิริยา PCR ใช้ดีเอ็นเอสายสั้น สุ่มเข้าคู่กับดีเอ็นเอของพืชแล้วจึงเพิ่มปริมาณโดยปฏิกิริยา PCR Extension 720C, 2 min. PCR 45 รอบ PCR 2 30 รอบ Primer Annealing 360C, 1 min. เปฏิกิริยา PCR 1 ng/ul plant DNA (total DNA) 1 Buffer 0.1 mM dNTPs0.6 uM Primer 0.02 unit/ul Taq DNA polymerase 6 mM MgCl, Gel analysis Gel analysis

3. วิเคราะห์ผลลายพิมพ์ดีเอ็นเอ (RAPD และ AFLP- markers) ของฝรั่ง ตัวอย่างลายพิมพ์ดีเอ็นเอ (RAPD- markers ) ของฝรั่ง 16 สายต้น

Marker GV1 GV6 GV7 GV4 GV2 GV16 GV8 GV9 GV10 GV11 GV12 GV13 GV14 GV15 GV3 GV5 กลมสาลี่ แป้นสีทอง สาลี่สีทอง แป้นยักษ์ เย็นสอง

Marker GV1 GV6 GV7 GV4 GV2 GV16 GV8 GV9 GV10 GV11 GV12 GV13 GV14 GV15 GV19 GV5 กลมสาลี่ แป้นสีทอง สาลี่สีทอง แป้นยักษ์ ขี้นก

ใช้ ไพรเมอร์ 13 ชนิดสามารถแยกแยกความแตกต่างระหว่างพันธุ์ 27 พันธุ์ กลมสาลี่ 2 แป้นสีทอง 5 แป้นสีทอง 6 แป้นสีทอง 7 แป้นยักษ์ 12 แป้นยักษ์ 13 สาลี่สีทอง 8 สาลี่สีทอง 11 สาลี่สีทอง 9 สาลี่สีทอง 10 แป้นยักษ์ 14 แป้นยักษ์ 15 ขี้นกไส้ขาว 25 ขี้นกไส้ขาว 26 ขี้นกไส้ขาว 29 ขี้นกไส้ขาว 27 ขี้นกไส้ขาว 28 กลมสาลี่ 3 แป้นสีทอง 4 ขี้นกไส้แดง 22 ขี้นกไส้แดง 23 ขี้นกไส้ขาว 24 ขี้นกไส้ขาว 17 ขี้นกไส้ขาว 18 ขี้นกไส้ขาว 19 ขี้นกไส้ขาว 20 ขี้นกไส้แดง 21 ใช้ ไพรเมอร์ 13 ชนิดสามารถแยกแยกความแตกต่างระหว่างพันธุ์ 27 พันธุ์ แล้ววิเคราะห์ความสัมพันธ์จาก ความเหมือนและไม่เหมือน ของ ลายพิมพ์ดีเอ็นเอ

4. ขั้นตอนและวิธีการปฏิกิริยา AFLP (Amplified Fragment Length Polymprphism) ลำดับของไพรเมอร์จำนวน 13 หมายเลข ที่ใช้ในการคัดเลือกไพรเมอร์ที่เหมาะสมในการ จำแนกสายพันธุ์ฝรั่ง หมายเลข รหัสไพรเมอร์ หมายเลข รหัสไพรเมอร์ 1 OPE-01 8 OPE-15 2 OPE-02 9 OPE-16 3 OPE-03 10 OPE-17 4 OPE-04 11 OPE-18 5 OPE-07 12 OPE-08 6 OPE-11 13 OPE-11 7 OPE-14

1. การเตรียมดีเอ็นเอ 1) ใช้ใบอ่อนของพืชมาสกัดดีเอ็นเอ ตามวิธีกรเดียวกันกับที่ใช้ RAPD ดังกล่าวข้างต้น แล้วปรับปริมาตรที่สกัดได้ทั้งหมดให้ได้ปริมาณ 100 ul. ในสารละลาย TE buffer 2) ปรับให้ได้ความเข้มข้น DNA 200 ng/ul (ใช้ DNA ที่สกัดได้จากข้อ 1 ประมาณ 2 ul 3) นำดีเอ็นเอเข้มข้น 200 ng/ul มาเตรียมทำปฏิกิริยาการเพิ่มดีเอ็นเอด้วยเทคนิค AFLP 2. ปฏิกิริยา AFLP 2.1 Digestion : ทำการตัดชิ้นส่วนของดีเอ็นเอด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะ 2 ชนิด ได้แก่ EcoRl และ Tru9l ด้วยส่วนประกอบของปฏิกิริยาดังนี้ DNA (200 ng/ul) 2 ul Tru9l (10 u/ul) 0.5 ul 10xBuffer A 2 ul dH2O 15 ul EcoRl (10 u/ul) 0.5 ul ได้ปริมาตรรวมทั้งสิ้น 20 ul นำส่วนผสมทั้งหมดบ่มที่อุณหภูมิ 34 องศาเซลเซียส 2 ชั่วโมง

2.2 Ligation : ทำการเชื่อมชิ้นส่วนของดีเอ็นเอด้วย Adaptor ด้วยส่วนประกอบ ของปฏิกิริยาดังนี้ 10x ligase buffer 1 ul dH2O 6 ul ER Adaptor (5 pmol/ul) 1 ul T4 DNA Ligase (1 u/ul) 1 ul MS Adaptor (50 pmol/ul) 1 ul ได้ปริมาตรรวม 10 ul - ใช้ปริมาตรทั้งหมดผสมลงใจส่วนผสมของ digestion อีก 20 ul ได้ปริมาตรรวม 30 ul. - บ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส 4 ชั่วโมง - หลังจากนั้นนำมาเช็คผลใน 1% Agarose gel (0.5% TBE buffer) โดยใช้ DNA จากขั้นตอนดังกล่าว 5 ul. ผสมกับ dyn 5 ul. ดังผลการตรวจสอบในภาพที่ 5 - นำมาเจือจางด้วยน้ำกลั่นที่นึ่งฆ่าเชื้อแล้ว 10 เท่า (225 ul.) ก่อนทำปฏิกิริยา PCR 2 ขั้นตอน ได้แก่ PCR I และ PCR II

2.3 PCR : ทำการเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอในขั้นตอนที่ 1 เช่นเดียวกับปฏิกิริยา RAPD ของปฏิกิริยาดังนี้ DNA (จากช่วง ligation ที่เจือจางแล้ว 10 เท่า) 10 ul 10x PCR Buffer 5 ul dNTP (1 mM) 10 ul ER-A-Primer (75 ng/ul) 1 ul Ms-C-Primer (75 ng/ul) 1 ul Taq DNA Polymerase (5u/ul) 0.2 ul ปริมาตรรวม 27.2 ul - นำส่วนผสมไปทำให้เกิดปฏิกิริยาด้วยเครื่อง PCR ที่ปรับอุณหภูมิและช่วงเวลาเท่ากับ ปฏิกิริยา RAPD ต่างกันตรงที่ PCRI ของ AFLP ใช้จำนวนรอบเพียง 20 รอบ - จากนั้นนำมาเจือจางด้วยน้ำกลั่นที่นึ่งฆ่าเชื้อแล้ว 5 เท่า (108.8 ul) ก่อนทำปฏิกิริยา ใน PCRII

3. ทำการตรวจผลด้วย Agarose gel และ Acrylamide gel โดยนำผลที่ได้จาก PCRII ผสมกับ Sequencing dyn 10 ul ได้ปริมาตร รวม 30 ul ใช้เพียง 10 ul เพื่อตรวจสอบผลขั้นต้นก่อน บน 1% Agarose gel ใน 0.5 x TBF Buffer ด้วยเครื่อง Mupid electrophoresis ขับเคลื่อน ด้วยกระแสไฟฟ้าแรงต่ำ 0.5 watt แล้วจึงไปตรวจผลที่แน่นอนบน 4.5% Acrylamide gel ใน 1 x TBF Bufferโดยเครื่อง Sequencer gel electrophoresis ขับเคลื่อนด้วย กระแสไฟฟ้าแรงสูง 50 watt ต่อ 1 gel เปรียบเทียบกับ maker Thinx 174 DNA/Hinf I นำเจลที่ได้ไปย้อม ด้วย ซิลเวอร์ เพื่ออ่านผลปฏิกิริยา AFLP

4. การย้อมเจลด้วยซิลเวอร์ (Silver staining) 1) Fixed ด้วย 10% Acetic acid นาน 20 นาที (ใช้ Shaker เขย่า) 2) ล้างด้วยน้ำกลั่นหรือน้ำกรองนาน 2 นาที 3 ครั้ง 3) ย้อมด้วย 1 g/L Silver nitrate ผสมกับ 37% formaldehyde 1.5 ml/L นาน 30-45 นาที ในที่มืด 4) ล้างด้วยน้ำกลั่นหรือน้ำกรอง แล้วรีบเทน้ำทิ้งทันที 5) Develop ด้วยสารละลาย developer จนกระทั่งเห็น band ชัดเจนดี แล้วเท developer ทิ้ง (ส่วนผสมของ developer ประกอบด้วย Sodium carbonate anhydrous 30 g. 10 mg/ml Sodium thiosulfate 250 ul 37% formaldehyde 1.5 ml. ในปริมาตรทั้งหมด 1 lite 6) Fixed ด้วย 10% acetic acid นาน 5 นาที 7) เทกรดอะซิติกทิ้ง แล้วล้างด้วยน้ำกลั่นอีกครั้งหนึ่งจนหมดกรดอะซิติก (ประมาณ 5 นาที) 8) นำแผ่นกระจกผึ่งให้แห้ง แล้วจึงอ่านผล

เย็นสอง Marker GV1 GV6 GV7 GV4 GV2 GV16 GV8 GV9 GV10 GV11 GV12 GV13 GV14 GV15 GV3 GV5 แป้นยักษ์ สาลี่สีทอง แป้นสีทอง กลมสาลี่ พบความแตกต่างของลายพิมพ์ดีเอ็นเอระหว่างสายต้นที่ระบุว่าเป็นพันธุ์เดียวกัน