การพัฒนาวิธีหา Aflatoxin B1 ในข้าวด้วยการใช้ Direct Competitive Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Modifide Direct Competitive Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for Aflatoxin B1 in rice

น.ส. รัตนา เกียรติทรงชัย ผู้ร่วมจัดทำ น.ส. นัดติยา ประกอบแสง D4810056 น.ส. รัตนา เกียรติทรงชัย m4810131

วัตถุประสงค์ เพื่อตรวจสอบและหาปริมาณของ alflatoxin B1 ในข้าว

การนำไปใช้ประโยชน์ เพื่อตรวจหาระดับของ alflatoxin B1 ที่ปนเปื้อนอยู่ในข้าว นอกจากนั้นยังเชื่อมโยงไปถึงการปนเปื้อนในนาข้าวและพื้นที่ใกล้เคียง

หลักการ ประยุกต์จากวิธีทดสอบของ Chu (1989) ในการทดลองของเราจะ coat แต่ละ well ของ microtiter plate ด้วย aflatoxin B1-oxime-BSA และ incubate ไว้ หลังจากล้างก็จะเติม ตัวอย่างข้าวที่ต้องการทดสอบหรือ aflatoxin B1 มาตรฐาน กับ anti-aflatoxin B1- BSA- HRP conjugate ลงไปพร้อมๆ กัน แล้ว incubate ต่อ สารพิษที่อยู่ในสารละลายข้าวหรือใน aflatoxin B1 มาตรฐาน จะแย่งจับกับ antigen ที่ติดอยู่กับผิวของ microtiter plate

และจะจับตรงบริเวณที่ antibody จะมาจับ หลังจากล้างอีกรอบ ก็จะตรวจสอบปริมาณของ antibody ที่จับอยู่บนผิวของ microtiter plate ได้โดย incubate กับสารละลาย substrate ผลของสีจากการทำปฏิกิริยาจะวัดโดยใช้เครื่อง spectrophotometer ปริมาณของ aflatoxin B1 ในตัวอย่างข้าวจะหาได้โดยการเทียบกับกราฟของ aflatoxin B1 มาตรฐาน

บทนำ Aflatoxin : สารพิษสร้างจากเชื้อราพวก Aspergillus flavus สารพิษตัวนี้จะทำลายเซลล์ตับอย่างรุนแรง และยังเป็นสารก่อมะเร็งที่รุนแรงมากอีกด้วย เชื้อราพวก Aspergillus flavus มักจะเจริญได้ในที่ที่มีความชื้นต่ำ เช่น ในเมล็ดธัญพืชทั้งถั่ว ข้าว เป็นต้น

วิธีการเตรียมสารเคมี ใช้สารเคมีระดับ AR grade สารละลายสกัดตัวอย่าง (Sample extraction solvent ) Carbonate coating buffer Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 เข้มข้น 10 เท่า

PBS-Tween Conjugate buffer Substrate buffer Enzyme Substrate

Aflatoxin B1-BSA เข้มข้น 500 เท่า Anti-Aflatoxin (B1) Peroxidase conjugate Blocking 1% Colour stop reagent 0.5 N

รูปแสดง ข้าวกะเทาะเปลือก ขัดขาว บดละเอียด

วิธีทำการทดลอง coat plate ด้วย Aflatoxin B1-BSA (sigma A6655) 100 ไมโครลิตร ต่อ well จะมีปริมาณ 2 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร Incubate ใน moist chamber ที่ 4°C ข้ามคืน ล้างด้วย PBS-T 3 ครั้ง block ด้วย BSA 1% 200 ไมโครลิตรต่อ well ที่ 37°C เป็นเวลา 1 ชั่วโมง

ล้างด้วย PBS-T 3 ครั้ง เติมสารละลายตัวอย่าง 50 ไมโครลิตรต่อ well แล้วตามด้วย Anti-AFB1- peroxidase conjugate 50 ไมโครลิตรต่อ well Incubate ใน moist chamber ที่ 37°C 45 นาที

เติม Enzyme Substrate 100 ไมโครลิตรต่อ well Incubate ในที่มืด 10-15 นาที หยุดปฏิกิริยาด้วย Colour stop reagent 25 ไมโครลิตรต่อ well อ่านค่าการดูดกลืนแสงที่ 492 นาโนเมตร

ผลการทดลอง

ตารางที่ 1 แสดงค่าการดูดกลืนแสงของ standard aflatoxin B1 ความเข้มข้น(ug/kg) ค่าการดูดกลืนแสงที่ 492 nm 7.5 0.215 15 0.218 30 0.220 60 0.212 120 0.213 240 480 0.196 960 0.207 1920 0.189 3840 0.137 7610 0.103

ตารางที่ 2 แสดงค่าการดูดแสงของตัวอย่างข้าวทั้ง 17 ตัวอย่าง ค่าการดูดกลืนแสงที่ 492 nm 1 ทองมา   0.387 2 นางเอียด 0.406 3 สมยศ 0.376 4 นางบุญเรือน 0.382 5 ประเสริฐ เคมี 0.402 5 ประเสริฐ อินทรีย์ 0.380 6 รำพัก 0.359 7 กัญญา 0.415 8 นายเรียบ 0.384 9 นายทอง 0.368 10 นางทอน 0.374 11 นายสนอง 0.370 12 ฮวด 0.348 13 ชวน 0.361 14 คำมี 0.369 15 นายนุ 0.347 16 นายมะลิ

รูปที่ 2 แสดงสีจากการทดสอบ standard aflatoxin ใน microtiter 96 well plate

สรุปผลการทดลอง ไม่พบ aflatoxin ในปริมาณที่เกินกำหนด จากตัวอย่างข้าวทั้ง 17 ชนิด

เอกสารอ้างอิง Anonymous. 1991. Aflatoxin analysis in groundnuts and groundnut products. Pages 195-278 in. The groundnut Aflatoxin problem: review and database (Mehan, V.K., Mcdonald, D., Haravu, L.J., and Jayanthi, S. eds.). Patancheru, AP. 502324, India :International Crops Research Institute for the Semi-Arid Tropics. Fan, T.S.L., and Chu, F.S. 1984. An indirect ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) for detection of aflatoxin B1 in corn and penut butter. Journal of Food Protection 47: 263-266

Chu, F.S. 1989. Current immunochemical methods for analysis of Aflatoxin in groundnuts and groundnut products. Pages 101-172. In Aflatoxin contamination of groundnuts : proceedings of the International workshop, 6-9 October 1987, ICRISAT Center, India. Patancheru, AP. 502324, India :International Crops Research Institute for the Semi-Arid Tropics. Wilson, D.M. 1989. Aflatoxin analytical methods for groundnut. Pages 191-199. Ibid Anajaiah, V., Mehan, V.K., Jayanthi, S., Reddy, D.V.R. and Mcdonald, D. 1989. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) for alflatoxin B1 estimation in groundnuts. Pages 1983-189. Ibid

FIN !! ไปต่อกันที่ WEB นะคะ