การเทียบความทึบแสง (Spectrophotometry) และการใช้เครื่อง Spectrophotometer DR. CHATCHAWAN SRISAWAT

Barfoed’s test (test for monosaccharides) BIOCHEMICAL ANALYSIS Qualitative (คุณภาพวิเคราะห์) to identify the components of a substance or mixture. e.g. xylose glucose fructose lactose sucrose (disaccharide) (monosaccharide) Barfoed’s test (test for monosaccharides) Negative Positive Commassie blue test (test for proteins)

ระดับน้ำตาลในพลาสมา = 105 mg/dl BIOCHEMICAL ANALYSIS Quantitative (ปริมาณวิเคราะห์) to determine the amounts or proportions of the components of a substance. e.g. ระดับน้ำตาลในพลาสมา = 105 mg/dl ระดับโปรตีนในซีรั่ม = 7.2 g/dl Gravimetry (การชั่ง) Accurate but may not be practical!

การเทียบความทึบแสง (Spectrophotometry) การวิเคราะห์หาค่าความเข้มข้นของสารโดยอาศัยความสามารถในการดูดกลืนแสงของสารที่ความยาวคลื่นหนีงๆ เป็นวิธีที่นิยมใช้ใน quantitative analysis

การเทียบความทึบแสง (Spectrophotometry) หลักการ สำหรับสารหนึ่งๆ จะมีการดูดกลืนแสงได้ดีที่ความยาวคลื่นหนึ่งๆ เรียกว่า lmax

การเทียบความทึบแสง (Spectrophotometry) หลักการ Io I Io = light intensity ก่อนผ่านสารละลาย hn I = light intensity หลังผ่านสารละลาย ความทึบแสง (absorbance หรือ optical density [O.D.]) = log Io/I Absorbance เป็น 0 เมื่อไม่มีการดูดกลืนแสง (I = Io) Absorbance > 0 เมื่อมีการดูดกลืนแสง (I < Io)

การเทียบความทึบแสง (Spectrophotometry) หลักการ Io I hn 0 2 4 8 mg/ml A a c c = ความเข้มข้นของสารละลาย A a l l = ระยะทางที่แสงผ่านสารละลาย l 1 l 2 Lambert-Beer’s law

A = e l c e = ค่าคงที่ของการดูดกลืนแสง (extinction coefficient) การเทียบความทึบแสง (Spectrophotometry) หลักการ A = e l c A= absorbance หรือ optical density (O.D.) e = ค่าคงที่ของการดูดกลืนแสง (extinction coefficient) l = ระยะทางที่แสงผ่านสารละลาย c = ความเข้มข้นของสารละลาย เมื่อ ระยะทางที่แสงผ่านคงที่ \ O.D. = constant x concentration ดังนั้น การวัดความทึบแสง สามารถใช้วิเคราะห์หาปริมาณ ของสารที่ต้องการตรวจสอบได้

การเทียบความทึบแสง (Spectrophotometry) ตัวอย่าง การหาความเข้มข้นของสาร A โดยวิธีเทียบความทึบแสง เครื่องวัดความทึบแสง (spectrophotometer) เตรียมสารละลายมาตรฐาน (standard solution) ของสาร A ที่รู้ความเข้มข้น e.g. ได้จากการชั่งสาร A และทำเป็นสารละลายที่มีความเข้มข้นที่ต้องการ เช่น 250, 500, 1500 mg/dl สารละลาย unknown ที่ต้องการวิเคราะห์

การเทียบความทึบแสง (Spectrophotometry) ตัวอย่าง การหาความเข้มข้นของสาร A โดยวิธีเทียบความทึบแสง - วิธีที่ 1 0.68 0.36 0.18 0.11 วัดค่าความทึบแสง (O.D.) ของ standard solutions แล้วนำมา plot standard curve. วัดค่าความทึบแสง (O.D.) ของ unknown แล้วอ่านค่าความเข้มข้นจาก standard curve. ถ้าอ่านค่า O.D. ของ unknown ได้ 0.45 ความเข้นข้นของสาร A ~ 1000 mg/dl

การเทียบความทึบแสง (Spectrophotometry) ตัวอย่าง การหาความเข้มข้นของสาร A โดยวิธีเทียบความทึบแสง - วิธีที่ 2 เนื่องจากความสัมพันธ์ระหว่าง O.D. และ ความเข้มข้นเป็นเส้นตรง O.D. = constant x concentration อาจวัดความทึบแสงโดยใช้ standard solution เพียงค่าเดียว แล้วคำนวณหาค่าความเข้มข้นของ unknown ดังนี้ Ds = constant x Cs Du = constant x Cu Ds, Du = O.D. ของน้ำยามาตรฐานและ unknown Cs, Cu = concentration ของน้ำยามาตรฐานและ unknown 1 2 Cu = Du x Cs Ds

การเทียบความทึบแสง (Spectrophotometry) ตัวอย่าง การหาความเข้มข้นของสาร A โดยวิธีเทียบความทึบแสง - วิธีที่ 2 เนื่องจากความสัมพันธ์ระหว่าง O.D. และ ความเข้มข้นเป็นเส้นตรง O.D. = constant x concentration อาจวัดความทึบแสงโดยใช้ standard solution เพียงค่าเดียว แล้วคำนวณหาค่าความเข้มข้นของ unknown ดังนี้ e.g. Ds ของ standard solution 1500 mg/dl = 0.68 Du ของ unknown = 0.45 Cu = 0.45 x 1500 mg/dl 0.68 Cu = Du x Cs Ds Cu = 992 mg/dl

การเทียบความทึบแสง (Spectrophotometry) ในกรณีที่สารที่ต้องการวิเคราะห์ไม่มีสี (นั่นคือ ไม่ดูดกลืนแสงในช่วง visible spectrum ซึ่งใช้ในการเทียบการทึบแสง) ???? ใช้ปฏิกิริยาที่จำเพาะกับสารที่ต้องการวัด และให้ product ที่มีสี ซึ่งจะมีปริมาณแปรผันตามปริมาณสารที่ต้องการวิเคราะห์และสามารถวัดได้โดยวิธี spectrophotometry protein (ไม่มีสี) + biuret product สีม่วง lmax = 550 nm 0 2 4 8 g/dl

การเทียบความทึบแสง (Spectrophotometry) ในกรณีที่สารที่ต้องการวิเคราะห์ไม่มีสี (นั่นคือ ไม่ดูดกลืนแสงในช่วง visible spectrum ซึ่งใช้ในการเทียบการทึบแสง) ???? ใช้ปฏิกิริยาที่จำเพาะกับสารที่ต้องการวัด และให้ product ที่มีสี ซึ่งจะมีปริมาณแปรผันตามปริมาณสารที่ต้องการวิเคราะห์และสามารถวัดได้โดยวิธี spectrophotometry glucose (ไม่มีสี) + glucose oxidase & chromogenic substrate product สีแดง lmax = 505 nm

การเทียบความทึบแสง (Spectrophotometry) ตัวอย่าง การวิเคราะห์ serum protein (วิธี biuret) หน้า 64 เตรียมหลอดทดลอง และเติมน้ำยาตามลำดับ Blank น้ำเกลือนอร์มัล (ml) 50 - - 4 - Standard Unknown น้ำยาโปรตีนมาตรฐาน 7 g/dl (ml) 50 - serum (ml) - 50 น้ำยา biuret (ml) 4 4 ผสมตั้งทิ้งไว้อย่างน้อย 5 นาที แล้วเทียบความทึบแสงที่ 550 nm

การเทียบความทึบแสง (Spectrophotometry) ตัวอย่าง การวิเคราะห์ serum protein (วิธี biuret) หน้า 64 หลอดน้ำยา blank คืออะไร? หลอดที่มีน้ำยาหรือสารทุกอย่างที่ใช้ทำปฎิกิริยา แต่ไม่มีสารที่ต้องการตรวจ hn Io I เนื่องจากตัวน้ำยาหรือสารที่ใช้ทำปฎิกิริยา อาจมีการดูดกลืนแสงได้บ้าง ดังนั้นจึงต้องเตรียมน้ำยา blank เพื่อใช้ปรับค่า O.D. ให้เป็น 0 ก่อนที่จะใช้วัด O.D. ของ standard หรือ unknown blank น้ำยา biuret น้ำยา biuret + protein unknown

การเทียบความทึบแสง (Spectrophotometry) ตัวอย่าง การวิเคราะห์ serum protein (วิธี biuret) หน้า ??? หลอดน้ำยา blank คืออะไร? หลอดที่มีน้ำยาหรือสารทุกอย่างที่ใช้ทำปฎิกิริยา แต่ไม่มีสารที่ต้องการตรวจ Standard Unknown น้ำยาโปรตีนมาตรฐาน 7 g/dl (ml) 50 - serum (ml) - 50 น้ำยา biuret (ml) 4 4 Blank น้ำเกลือนอร์มัล (ml) 50 - - 4 -

การใช้เครื่อง spectrophotometer Spectronic 20 - analog reading

การใช้เครื่อง spectrophotometer วิธีการใช้เครื่องจะมีบอกไว้ที่ตัวเครื่อง ให้นักศึกษาทำไปตามขั้นตอนดังกล่าว

การใช้เครื่อง spectrophotometer 1. Turn on - warm up 15 min ทางห้อง lab จะทำการเปิดเครื่องและ warm up ให้ก่อนการใช้งาน

การใช้เครื่อง spectrophotometer 2. Set zero % transmittance hn Io I Transmittance = I Absorbance (O.D.) = log (Io/I)

การใช้เครื่อง spectrophotometer 3. Set wavelength Wavelength adjustment knob ปกตินักศึกษาไม่ต้องปรับ wavelength เอง ทางห้อง lab จะปรับให้ แต่ควรตรวจสอบให้แน่ใจว่า เครื่องที่ใช้วัด ได้ตั้งค่า wavelength ที่ถูกต้อง

การใช้เครื่อง spectrophotometer 4. Insert blank ถ่ายน้ำยา blank ลงใน cuvette แล้ว ใส่ลงใน cuvette holder

การใช้เครื่อง spectrophotometer Cuvette = หลอดแก้วพิเศษสำหรับใช้ในการเทียบความทึบแสง สารละลายที่ใช้จะวัดความทึบแสงจะถูกถ่ายลงใน cuvette ก่อนที่จะใส่ลงในเครื่อง spectrophotometer ให้นักศึกษาใช้ด้วยความระมัดระวังเนื่องจากมีราคาแพง cuvette

การใช้เครื่อง spectrophotometer การใช้ cuvette ควรมีน้ำยาใน cuvette ~ 1/2 ของหลอด (อย่างน้อยสุด ~ 1/3) hn Io I ก่อนใช้ cuvette ควร rinse cuvette ด้วยน้ำยาที่จะอ่าน 1-2 ครั้ง แต่ไม่ควรใช้น้ำยา rinse มาก จนทำให้เหลือน้ำยาไม่พอสำหรับอ่าน O.D.

การใช้เครื่อง spectrophotometer การใช้ cuvette จับ cuvette ให้ถูกวิธี ก่อนที่จะใส่ cuvette ลงในเครื่อง spectrophotometer ให้เช็ดข้างหลอดด้วยกระดาษทิชชูให้สะอาดเสมอ

การใช้เครื่อง spectrophotometer การใช้ cuvette sample holder ของเครื่อง spectronic 20 จะมีขีด (ลูกศรชี้) ที่เป็นเครื่องหมาย เพื่อให้ใส่ cuvette ได้ถูกต้อง โดยเครื่องหมายขีดขาวบนหลอด cuvette ต้องตรงกับขีดบน cuvette holder

การใช้เครื่อง spectrophotometer 4 -5. Insert blank - set 0 absorbance or 100% transmittance (set full scale) hn Io I blank น้ำยา biuret น้ำยา biuret + protein unknown

การใช้เครื่อง spectrophotometer 6-7. Insert unknown - Read absorbance

การใช้เครื่อง spectrophotometer * การอ่านค่าจากเครื่อง spectronic ที่เป็น analog reading ควรมีความรอบคอบในการอ่าน โดยเฉพาะการอ่านค่าจุดทศนิยมและการแบ่ง scale ซึ่งเป็นขั้นตอนที่มักผิดพลาดได้บ่อย

การใช้เครื่อง spectrophotometer Thermo Spectronic - digital reading

การใช้เครื่อง spectrophotometer Wavelength adjustment knob ปุ่มปิด/เปิด ปุ่ม set zero absorbance (set full scale)

การใช้เครื่อง spectrophotometer ถ้าต้องการอ่าน absorbance ให้กด switch มาที่ตำแหน่งดังกล่าว วิธีการใช้เครื่อง

การใช้เครื่อง spectrophotometer 1. Turn on - warm up 15 min 2. Set wavelength * เครื่อง Thermospectronic ไม่ต้อง set zero transmittance เหมือนเครื่อง Spectronic 20

การใช้เครื่อง spectrophotometer 3 - 4. Insert blank and set zero absorbance (set full scale) 5-6. Insert sample and read absorbance

การวิเคราะห์ serum protein (วิธี biuret) สรุปสิ่งที่ต้องทำ การวิเคราะห์ serum protein (วิธี biuret) เตรียมหลอดทดลอง และเติมน้ำยาตามลำดับ Blank Standard Unknown น้ำยาโปรตีนมาตรฐาน 7 g/dl (ml) 50 - serum (ml) - 50 น้ำยา biuret (ml) 4 4 น้ำเกลือนอร์มัล (ml) 50 - - - - 4 ผสมตั้งทิ้งไว้ 5 นาที แล้วเทียบความทึบแสงที่ 550 nm คำนวณความเข้มข้นของโปรตีนในสารละลาย unknown Cu = Du x Cs Ds

นักศึกษาอาจได้ unknown ซีรั่มที่มีหมายเลขแตกต่างกัน ซึ่งค่าของ unknown คือ No. table หารด้วย 3 เหลือเศษ 1 = unknown หมายเลข 1 = 4.0 (3.4 – 4.5) g/dl No. table หารด้วย 3 เหลือเศษ 2 = unknown หมายเลข 2 = 7.7 (7.3 – 8.2) g/dl No. table หารด้วย 3 ลงตัว = unknown หมายเลข 3 = 9.7 (9.4 – 10.0) g/dl ปรึกษาอาจารย์ผู้ดูแลในห้องถึงวิธีใช้ และ สาเหตุที่อาจทำให้ได้ค่าไม่แม่นยำ อาจจะทำซ้ำได้ถ้าต้องการแก้ไขข้อบกพร่องหรือเพิ่มความชำนาญ