งานนำเสนอกำลังจะดาวน์โหลด โปรดรอ

งานนำเสนอกำลังจะดาวน์โหลด โปรดรอ

Single nucleotide polymorphism(S) or mutation(S) of gene in haemostasis Dr. Worawan Chumpia Faculty of Associated Medical Sciences Khon Kaen University.

งานนำเสนอที่คล้ายกัน


งานนำเสนอเรื่อง: "Single nucleotide polymorphism(S) or mutation(S) of gene in haemostasis Dr. Worawan Chumpia Faculty of Associated Medical Sciences Khon Kaen University."— ใบสำเนางานนำเสนอ:

1 Single nucleotide polymorphism(S) or mutation(S) of gene in haemostasis Dr. Worawan Chumpia Faculty of Associated Medical Sciences Khon Kaen University

2 Objective 1. คำจำกัดความ SNP(s) หรือ mutation(S) 2. ชนิดของ SNP(s) 3. เทคนิคทางห้องปฏิบัติการที่ใช้ในการตรวจหา SNP(s) หรือ mutation(s) 4. การนำเอา bioinformatic tools มาช่วยในการ วิเคราะห์ผล

3 ทำไมมนุษย์แต่ละคน แต่ละเชื้อชาติถึงมีความ แตกต่างกัน ความสูง สีผิว เส้นผม เลนส์ตา ความรุนแรงของโรค Identical Twin Single nucleotide polymorphism(S) or mutation(S) of gene in haemostasis ?

4 Nucleic alteration or DNA polymorphism or genetic polymorphism : การเปลี่ยนแปลงรหัสพันธุกรรม หรือความ หลากหลายของดีเอ็นเอที่เป็นลักษณะปกติของ ประชากร ความหลากหลาย เกิดจาก การ เปลี่ยนแปลงของลำดับเบสในจีโนมของมนุษย์ ทำให้ แต่ละบุคคลมีลำดับเบส ณ ตำแหน่งเดียวกันบน โครโมโซมหนึ่งแตกต่างกัน หรือ อัลลีล (allele) ที่ แตกต่างกัน Nucleic alteration

5 ความหลากหลายทางพันธุกรรมเกิด จาก – การกลายพันธุ์ (mutation) ที่เกิดขึ้นตาม ธรรมชาติ – มีการคัดเลือกพันธุ์ตามธรรมชาติ (natural selection) – มีการถ่ายทอดจากรุ่นหนึ่งไปสู่อีกรุ่นหนึ่ง – มีค่าความถี่  ร้อยละ 1

6 Generation 1 Single Nucleotide Polymorphism (SNP) Generation 2 Generation n ความถี่ของการถ่ายทอดการกลายพันธุ์ ในประชากรในแต่ละรุ่น  ร้อยละ 1 Nucleic alteration

7 Mutations – การกลายพันธุ์ (mutation) ที่ตำแหน่งสำคัญ ของยีน – สามารถถ่ายทอดจากรุ่นหนึ่งไปสู่อีกรุ่นหนึ่ง – เป็นการกลายพันธุ์ที่มีลักษณะการ แสดงออก (phenotype) ต่างจากคนปกติ และสามารถก่อให้เกิดโรคได้ – มีค่าความถี่ < ร้อยละ 1

8 Type of SNPs ขึ้นกับตำแหน่งของความหลากหลาย (polymorphisms) บนยีน ที่มีผลต่อการควบคุม (regulation) และการทำหน้าที่ (function) ของ โปรตีนนั้นๆ 5’ UTR Exon1 intron1 Exon 2 intron2 Exon 3 3’ UTR

9 Type of SNPs 1. SNP บริเวณ 5’UTR มีผลทำให้เกิดการสร้าง โปรตีนได้มากขึ้นหรือลดลง 2. บริเวณแอกซอนต่างๆมีผลทำให้โปรตีนที่สร้าง ขึ้นมาทำงานปกติ หรือลดลง - Synonymous SNP or hidden mutation or silent mutation - Nonsynonymous SNP alter amino acid: missense mutation, nonsense mutation, etc.

10 3. บริเวณอินทรอน (noncoding sequence, or intervening sequence(IVS) )  Variable number of tandem repeat (VNTR): การมีจำนวนชุดที่แตกต่างกันของ ลำดับเบสที่เหมือนกันเรียงต่อกัน Type of SNPs (continued)

11  minisatellite : การซ้ำกันของลำดับเบสเป็น ชุดๆ แต่ละชุดมีจำนวนเบส เบส  microsatellite : การซ้ำกันของลำดับเบสเป็น ชุดๆ แต่ละชุดมีจำนวนเบส 2-6 เบส Type of SNPs (continued)

12  Minisatellite - GCATCGGACCAATCGATCGGACCAATCGATCGGACC AATCG (n=3) - GCATCGGACCAATCGATCGGACCAAT CGATCGGACCAATCGATCGGACCAATCG(n=4) - GCATCGGACCAATCG (n=1)  Microsatellite –ATTACACACACACAATTTT (n=5) –ATTACACACACACACACACAATTT (n=8) –ATTACACACACACACACACACACACAATTTT (n=11)

13 4. บริเวณ splicing junction มีผลทำให้โปรตีนที่ สร้างขึ้นมาผิดปกติ frameshift mutation, deletion, insertion intron Type of SNPs (continued)

14 5. บริเวณ 3’UTR หรือ poly A tail ทำให้โปรตีนที่ถูก สร้างขึ้นมาถูกทำลายเร็วกว่าปกติ Type of SNPs (continued) AAAAAAAAAAAA CACAAACCCCAAAA protease

15 ความสำคัญของความ หลากหลายทางพันธุกรรม 1. ตรวจหายีนที่มีความสัมพันธ์กับโรค 2. พัฒนายาที่มีความจำเพาะ (pharmacogenomics) กับกลุ่มบุคคลในแต่ละโรค 3. การเลือกวิธีการรักษาของแต่ละบุคคลให้ตรงกับ โรค 4. การป้องกันและการปฏิบัติตัวของบุคคลที่มียีน เกี่ยวข้องกับโรคต่างๆ

16 How to find dbSNPs related with disease? Search engine Google NCBI

17 Human Genome base DatabaseSNP

18 Concept study of Monogenic disease Gene1 ResponderNonresponder Drug1  HIV disease Reverse transcriptase Acyclovir

19 Concept study of polygenic disease TRAIT Marker locus Causal Locus - Map location - DNA sequences - Disease - population Linkage Disequilibrium (LD) PEDIGREE Association -RFLP -SSCP -VNTR -(CA)n etc

20 Platelet(s) –GP Ia, Ib –GP IIb –GP IV Single nucleotide polymorphism(S) or mutation(S) in haemostasis

21 Coagulation factor (S) Factor I Factor II Factor III Factor V Factor VII Factor VIII Factor IX Factor X Factor XI, XII Factor XIII

22 Fibrinolytic system –Plasminogen –Plasmin –t-PA –PAI –Antiplasmin Single nucleotide polymorphism(S) or mutation(S) in haemostasis

23 Natural inhibitor (S) – Protein C – Protein S – Antithrombin – Throbomodulin – TFPI Single nucleotide polymorphism(S) or mutation(S) in haemostasis

24 Adhesion Activation Secretion Aggregation PLatelet(s)

25 Coagulation factor(s)

26 Natural inhibitor(s)

27 Tissue factor pathway inhibitor (TFPI) Natural inhibitor(s):

28 การตรวจทางห้องปฏิบัติการที่ใช้ในการ ตรวจหา SNPs 1.Restriction fragment length polymorphism (RFLP) or PCR-RFLP 2.Allele specific PCR amplification 3.Single strand conformation polymorphism (SSCP) 4. Heteroduplex mobility assay (HMA) 5. 5’ nuclease reaction

29 การตรวจทางห้องปฏิบัติการที่ใช้ใน การตรวจหา SNPs 6. Molecular beacons 7. Pyrosequencing 8. Allele specific oligonucleotide hybridization 9. Invader assay 10. Sequencing 11. Microarray : high throughput technology 12. MALDI-TOF Mass spectometry: high throughput technology

30 Deep Vein Thrombosis (DVT) หมายถึงภาวะที่มีลิ่มเลือดไปอุดตันที่บริเวณ หลอดเลือดดำชั้นลึก การที่มีลิ่มเลือดเข้าไปอุด ตันทำให้ไปขัดขวางการไหลเวียนของเลือด และเมื่อมีการแตกของลิ่มเลือดเป็นชิ้นเล็กๆ (thromboembolism) เข้าไปในกระแสเลือดจะ เข้าไปอุดกั้นส่วนต่างๆของร่างกาย เช่น สมอง ปอด หัวใจ ซึ่งอาจทำให้เป็นอันตรายแก่ผู้ป่วย ได้

31 สาเหตุ 1. ทางพันธุกรรม เช่น - protein C - protein S - antithrombin III - factor V Leiden - prothrombin G20210A mutation 2. ได้รับมา (acquired type):

32 ความผิดปกติเชื้อชาติ ThaiChineseCaucasian Protein S deficiency Protein C deficiency Antithrombin deficiency Factor V Leiden Prothrombin gene mutation Elevated fibrinogen Elevated factor VIII Elevated factor IX Hyperhomocysteinnem ia Antiphospholipid antibodies Malignancy 12.3 % 8.9 % 4.7 % 0 % 33.3 % 30.4 % 26.8 % 5 % 10 % 19 % 8-33 % 4-19 % 4 % 0 % % 1-3 % 3-5 % 1 % 20 % % 25 % 19 % % 10 % 9-25 %

33 Materials and Methods 1.Criteria 1.1 กลุ่มควบคุม คนปกติที่ได้ทำการตรวจวัดเพื่อหาระดับแอคทิวิตีของโปรตีนซี ซึ่งมีค่าอยู่ในช่วงระหว่าง % ซึ่งได้ทำการตรวจยีนของ โปรตีนซีและทราบว่าลำดับนิวคลีโอไทด์ในจีโนมทั้งหมดของ โปรตีน ซี ปกติ นำมาใช้เป็นตัวควบคุมในการทำ heteroduplex mobility assay (HMA) ทุกแอกซอนของโปรตีนซี 1.2 กลุ่มผู้ป่วย เป็นผู้ป่วยที่มีภาวะหลอดเลือดดำอุดตันจากลิ่มเลือดที่เข้ารับการ รักษาที่โรงพยาบาล และได้รับการวินิจฉัยว่าเป็น DVT โดยที่มี ผลบวกต่อเกณฑ์ที่ใช้ในการศึกษาครั้งนี้อย่างน้อย 1 อย่าง ซึ่งเกณฑ์ที่ใช้ในการศึกษาของกลุ่มผู้ป่วย DVT คือ 1) มีประวัติครอบครัวซึ่งมีภาวะ DVT 2) อาการแสดงของการเกิดภาวะลิ่มเลือดอุดตันที่แขน, ขา หรือ ตามอวัยวะอื่น ๆอย่างน้อย 1 ครั้ง 3) ให้ผลบวกต่อการตรวจพิเศษ 4) ระดับแอกทิวิตีของโปรตีน ซี ต่ำหรืออยู่ในช่วง borderline

34 2 สิ่งส่งตรวจ เจาะเลือดใส่ 3.2% โซเดียมซิเตรดนำไปปั่น แยกพลาสมา นำพลาสมาไปเก็บไว้ที่ -70oC เพื่อรอการตรวจวัดระดับแอกทิวิตี และระดับ แอนติเจนของโปรตีนเอส ส่วนเม็ดเลือดขาว นำมาสกัดดีเอ็นเอโดยใช้ชุดสกัดดีเอ็นเอ Genomic DNA Mini Kit (Geneaid Biotech) Materials and Methods

35 3.1 การทำ polymerase chain reaction (PCR) - การเพิ่มจำนวนชิ้นส่วยดีเอ็นเอในแต่ละแอก ซอนของจีนโปรตีนซี ด้วยวิธี PCR และตรวจผลการเพิ่มจำนวนดี เอ็นเอ : initial denaturation 95C, 4 mins - Denaturation 95 C, 30 S - annealing 62 C, 30 S - extention 72 C, 30 S final extention: 72 C, 10 mins Materials and Methods 30 rounds

36 Methods 1.5% Agarose Gel PCR products

37 3.2 ทำ Heteroduplex Mobility Analysis (HMA) Screen SNPs, mutations ส่วนประกอบ Control Heteroduplexes Unknown -10X Anneal buffer111 -PCR ของกลุ่มควบคุม 84- -PCR ของกลุ่มผู้ป่วย Loading dye111 Total volume10 µl10 µl10 µl Materials and Methods

38 Methods - นำ microtube ที่เติมส่วนผสมต่าง ๆ เรียบร้อยแล้วมาทำให้ความร้อนที่อุณหภูมิ 95 C เป็นเวลา 5 นาที โดยใช้เครื่อง thermal cycle เพื่อทำให้สายคู่ของดีเอ็นเอ (dsDNA) แยกออกกลายเป็นสายเดี่ยวของดีเอ็นเอ (ssDNA) จากนั้นนำมาแช่ในน้ำแข็งทันทีเป็น เวลา 10 นาที

39 Heteroduplex mobility assay (HMA)

40 การตรวจกรองมิวเตชั่นหรือโพลิมอร์ฟิสม โดย เตรียม non-denaturing polyacrylamide gel มี ขั้นตอนดังนี้ 10% PAGE, 2.6% C ส่วนประกอบ ปริมาตร - 30% acrylamide-bis4.0 ml -10XTBE0.5 ml -10%APS100 ul - TEMED 10 ul - dH2O5.5 ml และ urea 0.5 g set PAGE 1 hr Methods

41 ตัวอย่างส่งตรวจที่ตรวจพบว่ามีการแถบดีเอ็นเอที่ผิดปกติ จากการตรวจกรองหามิวเตชั่นของโปรตีน ซี ด้วย Heteroduplex mobility assay (HMA) นำมาตรวจยืนยันด้วยวิธี sequencing ต่อไป Methods

42 นำผลที่ได้จากการทำ Sequencing ของ ตัวอย่างส่งตรวจมาเปรียบเทียบกับผล Sequencing ของคนปกติ เพื่อตรวจหาชนิด ของลำดับเบสที่ผิดปกติไป โดยนำมา วิเคราะห์การเรียงตัวของ นิวคลีโอไทด์ด้วยโปรแกรมสำเร็จรูป BioEdit Download BioEdit มาติดตั้งใน drive C Methods Hall, T.A BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucl. Acids. Symp. Ser. 41:95-98.

43 Methods เปรียบเทียบ text file และ chromatogram file ระหว่างคนปกติกับผู้ป่วย โดยใช้ Bioedit program

44 14% PAGE, 2.6% C, 70 Volt,8 hrs, 4  C Result

45 14% PAGE, 2.6% C, 70 Volt,8 hrs, 4  C Result

46 Ho He SSDNA M 1 1* M 2 2* C 14% PAGE, 2.6% C, 70 Volt,8 hrs, 4  C

47 Methods

48 Wild type Heterozygote Mutant

49 PAGE Wild typeHeterozygote

50 Result จากการนำ bioinformatic tool มาใช้ทำให้ สามารถทราบตำแหน่งที่นิวคลิโอไทด์ เปลี่ยนแปลงไป amino acid เปลี่ยนแปลง หรือไม่


ดาวน์โหลด ppt Single nucleotide polymorphism(S) or mutation(S) of gene in haemostasis Dr. Worawan Chumpia Faculty of Associated Medical Sciences Khon Kaen University.

งานนำเสนอที่คล้ายกัน


Ads by Google