DNA synthesis and repair รัชนีกร กัลล์ประวิทธ์ 2557

Outline DNA replication DNA polymerase and other proteins in DNA replication Telomere and telomerase DNA synthesis using RNA template Damage to DNA and mutation DNA repair DNA repair defect

ความสำคัญของการสังเคราะห์ DNA ถ่ายทอดข้อมูลทางพันธุกรรมจาก cell เดิมไปให้ cell ใหม่ ที่จะเกิดขึ้น (DNA replication) เพื่อให้ cell ใหม่ มีลักษณะ และคุณสมบัติต่างๆ เหมือน cell เดิม parental cell daughter cell (diploid) (diploid) ซ่อมแซม DNA (DNA repair) เพื่อรักษาข้อมูลทางพันธุกรรมของ cell ไว้ให้คงเดิม

DNA replication เกิดใน S-phase (synthesis phase) ของ cell cycle DNA แต่ละสายทำหน้าที่เป็น template ในการสร้าง DNA สายใหม่ โดยเบสที่จำเพาะกันจะจับคู่กัน คือ A จับคู่กับ T และ G จับคู่กับ C เมื่อเสร็จสมบูรณ์ จะได้ DNA สายคู่ 2 โมเลกุล ที่มีลำดับเบสเหมือน DNA ตั้งต้น เรียกว่า semiconservative replication

Semiconservative replication ในแต่ละ molecule ของ DNA ที่เกิดขึ้นใหม่ ประกอบด้วย polynucleotide เดิม 1 สาย และสายใหม่ 1 สาย

Semiconservative replication 1 A A C T G G G G T T C C A 2 T T G A C C C C A A G G T 1 A A C T G G G G T T C C A 2 T T G A C C C C A A G G T T T G A C C C C A A G G T A A C T G G G G T T C C A Semiconservative replication C G T A

ปัจจัยสำคัญที่ใช้ในการสังเคราะห์ DNA DNA template dNTP : dATP, dGTP, dCTP และ dTTP RNA primer : polyribonucleotide สายสั้น ๆ ใช้เป็นจุดเริ่มต้นการสังเคราะห์ DNA Enzyme และ protein ชนิดต่าง ๆ เช่น DNA polymerase, DNA ligase, DNA gyrase, primase, SSB, DnaC เป็นต้น พลังงาน (ในรูป ATP) ที่ใช้ในการคลายเกลียวและต่อสาย DNA

Origin of replication เป็นจุดเริ่มต้นของ DNA replication Replication process จะเคลื่อนที่จาก origin of replication ออกไปทั้ง 2 ทิศทาง (bidirectional) Prokaryotic cells จะมี origin of replication ตำแหน่งเดียว Eukaryotic cells มีหลาย origin of replication บน chromosome เดียวกัน จึงเกิดการสังเคราะห์ DNA สายสั้น ๆ หลายสายพร้อมกัน ทำให้การถอดแบบเสร็จเร็วขึ้น

DNA replication Unwinding of DNA helix : helicase Relaxation of supercoiled DNA : DNA gyrase RNA primer synthesis : primase DNA synthesis : DNA polymerase III Leading strand Lagging strand Removal of RNA primer & filling gaps : DNA polymerase I Sealing of DNA chain : DNA ligase

Replication begins with the unwinding of the Ori C (origin site) Tandem array of 13-mer seq. Binding site for DnaA protein E.coli 5' GATCTNTTNTTTT 3' 3' CTAGANAANAAAA 5' Ori C locus - 245 bp - tandem array of three 13-mers with nearly identical sequences (AT rich) Dna A binds to Ori C initiate sequence of steps of DNA synthesis

HU : histone like protein stimulates initiation

New strands Origin of replication Replication forks Parental strands Bidirectional replication of a circular chromosome Replication เริ่มเกิดที่ origin of replication โดยเกิดทั้ง 2 ทิศทางในขณะเดียวกัน

+ Eukaryotic cells มี origin of replication หลายแห่ง O O = origin ส่วนของ DNA ที่ตั้งต้นจากจุดเดียวกันเรียกว่า replicon O O O O O O +

Unwinding of DNA helix เอนไซม์ helicase (Dna B) ทำให้เกิดการคลายเกลียว DNA โดยขั้นตอนนี้ต้องใช้พลังงานจาก ATP จุดที่ DNA คลายเกลียวออกจะมีลักษณะเป็นง่าม เรียกว่า replication fork DNA สายเดี่ยวที่เกิดจากการคลายเกลียวจะมีโปรตีนชื่อ single stranded DNA binding protein มาจับเพื่อป้องกัน DNA พันเป็นเกลียวใหม่

Relaxation of supercoiled DNA การคลายเกลียว DNA จะทำให้เกิด supercoil ใน DNA บริเวณถัดไป (DNA บริเวณใกล้เคียงกับ DNA ที่คลายเกลียวจะพันกันแน่นกว่าปกติ) DNA gyrase ทำหน้าที่ตัดเกลียวออกแล้วหมุนให้ supercoil คลายตัวและต่อปลายที่ตัดออกให้เชื่อมกันดังเดิม

DNA gyrase (DNA topoisomerase II) ทำหน้าที่คลายเกลียวของ DNA ที่ขดกันแน่น (supercoil) ซึ่งเกิดจากการที่ DNA ตำแหน่งข้างเคียงมีการคลายเกลียวโดย DNA helicase ตามขั้นตอนดังต่อไปนี้ DNA gyrase ตัด DNA duplex ส่วนที่มี supercoil ออก เกิดการหมุนของ DNA duplex เพื่อให้ supercoil คลายออก ต่อปลาย DNA duplex ที่คลายออกแล้วเข้ากับ DNA ข้างเคียงดังเดิม Porkaryotic DNA gyrase จะถูก inhibit โดยสารต่าง ๆ ได้แก่ Streptomyces derived novobiocin Oxolinic acid, Nalidixic acid ทำให้ bacteria ไม่สามารถแบ่งเซลล์เพิ่มจำนวนได้

RNA primer synthesis การสังเคราะห์ DNA จะเริ่มต้นได้ต้องมีการสังเคราะห์ RNA primer ที่มีความยาวประมาณ 50-100 nucleotide ขึ้นมาก่อน Primase ซึ่งเป็น RNA polymerase ชนิดหนึ่ง ทำหน้าที่สังเคราะห์ RNA primer จาก DNA template โดยมีทิศทาง การสังเคราะห์จาก 5’ 3’

DNA synthesis การสังเคราะห์ DNA จะเกิดต่อจากปลายของ RNA primer ในทิศทาง 5’ 3’ (และตรงข้ามกับสาย DNA template ซึ่งมีทิศทางจาก 3’ 5’ โดยใช้ DNA polymerase III holoenzyme และ dNTP เป็น substrate nucleotide ที่มาต่อกันเป็นสายใหม่ จะมีเบสที่ complementary กับ template หรือกล่าวได้ว่า สาย nucleotide ที่สังเคราะห์ขึ้นมาใหม่มีลำดับเบสเหมือนกับ DNA สายเดี่ยวที่แยกออกไป การสังเคราะห์ DNA สายใหม่จะเกิดขึ้นสองสายในทิศทางตรงกันข้าม โดยสายหนึ่งเรียกว่า leading strand ส่วนอีกสายเรียกว่า lagging strand

DNA synthesis Leading strand เป็น DNA สายใหม่ที่เกิดการสังเคราะห์ต่อกันเป็นสายยาวไปในทิศทางเดียวกันกับการเคลื่อนที่ของ replication fork Lagging strand เป็น DNA ที่ประกอบด้วย DNA สายสั้น ๆ (fragment) จำนวนมาก ทิศทางการสังเคราะห์จะสวนทางกับ replication fork โดยแต่ละ fragment เรียกว่า Okasaki fragment Okasaki fragment เกิดจาก DNA polymerase สังเคราะห์ nucleotide ได้เฉพาะในทิศทาง 5’ 3’ เท่านั้น

Removal of RNA primer and filling gaps RNA primer ถูกตัดออกโดย DNA polymerase I จะตัด nucleotide ทางปลาย 5’ ออกทีละตัว ช่องว่างที่เกิดจากการตัด RNA primer ออก จะถูกแทนที่ด้วย deoxyribonucleotide ที่มีเบส complementary กับ template โดย DNA polymerase I ใน leading strand หลังการตัดสาย RNA primer ออกแล้ว จะได้ DNA สายยาวสายเดียว ส่วนใน lagging strand จะได้ DNA สายสั้น ๆ หลายสาย

Sealing of DNA chain DNA ligase ทำหน้าที่เชื่อมปลาย 3’-OH ของ Okazaki fragment กับปลาย 5’-phosphate ของ Okazaki fragment ที่อยู่ติดกัน นอกจากนี้ DNA ใน leading strand ที่เกิดจาก origin of replication คนละจุดกัน สามารถต่อกันเป็นสายยาวด้วย DNA ligase เช่นกัน การทำงานของ DNA ligase ใน eukaryotic cells ต้องใช้ ATP

3' 5' A T T G C A T A A C G T 5' 3' 3' 5' A T T G C A T A A C G T 5' OH 3' H2O3 PO ATP DNA ligase AMP +PPi H2O 3' 5' A T T G C A T A A C G T H 5' O O P 3' O O

DNA polymerase catalyzes a template-directed synthesis of DNA from dNTP requires free 3'-OH group synthesis in the 5' 3' direction Uses dATP, dGTP, dCTP, and dTTP as substrates

DNA polymerase DNA polymerase in prokaryotes (E. coli) DNA polymerase II DNA polymerase III DNA polymerase in eukaryotes

DNA polymerase I 10 nucleotides / sec / mol-enzyme Polymerase activity (5’ 3’) 3’ 5’ exonuclease activity ทำหน้าที่ proofreading 5’ 3’ exonuclease activity ทำหน้าที่ error-correcting ใช้ใน DNA synthesis (ต่อ Okazaki fragment), remove primer, filling gaps, DNA repair

DNA polymerase I มี activity ของ enzyme 3 ชนิด อยู่ในตัวเอง 1. 3' 5' exonuclease proof-reading A T C HO 5' 3' H2O site ^ 2. 5' 3' exonuclease error-correcting, remove primer 3' 5' exonuclease 5' 3' polymerase N C small fragment large fragment ( Klenow fragment ) 3. polymerase

DNA polymerase II DNA repair Multisubunit enzyme (>4 subunits) 40 nucleotides/ sec/ mol-enzyme 3' 5’ exonuclease activity ทำหน้าที่ proofreading DNA repair

DNA polymerase III holoenzyme multisubunit enzyme 1000 nucleotides / sec / mol-enzyme highly possessive เนื่องจาก β subunit ช่วยยึด core enzyme ให้ติดกับ DNA template ทำให้ enzyme ไม่หลุดจาก DNA template ง่ายๆ ทำให้มีการ form phosphodiester bond จำนวนหลายแสน bond ก่อนที่ enzyme จะถูกปล่อยออกจาก template เมื่อ replicate เสร็จ Replicative chain elongation (leading & lagging strand)

DNA polymerase III 3' 5’ exonuclease activity ทำหน้าที่ proofreading activity ช่วยป้องกันไม่ให้เกิดการ mutation ระหว่างที่มี DNA replication

DNA polymerases in eukaryotes (e.g. humans) DNA polymerase α (replication)* – สังเคราะห์ short primer (RNA or DNA) for Okazaki fragments on a lagging strand 2. DNA polymerase β (repair)* DNA polymerase γ (replication of mitochondrial DNA)* ทั้ง3 ชนิดไม่มี 3' 5' exonuclease or proofreading activity 4. DNA polymerase δ (replication) อยู่ใน nucleus มี 3' 5' exonuclease or proofreading activity – สังเคราะห์ leading และ lagging stand (คล้าย DNA pol III ใน prokaryote) DNA polymerase  (repair, replication – RNA primer removal คล้าย DNA pol I ใน prokaryote) หลังจากสังเคราะห์จะมี modification ของ DNA โดยการเติม methyl groupให้กับเบส เช่น C5 ของ cytosine ด้วย SAM

DNA synthesis using RNA template RNA dependent DNA polymerase DNA synthesis using RNA template เกิดโดยเอนไซม์ reverse transcriptase (RNA dependent DNA polymerase) พบในไวรัสบางชนิด เช่น ไวรัสที่ทำให้เกิดโรคมะเร็ง (Rous sarcoma, Avian myeloblastosis, Raucher murine leukemia), ไวรัสที่ทำให้เกิดโรคเอดส์ (HIV)

การสังเคราะห์ DNA ที่ใช้ RNA เป็น template retrovirus RNA reverse transcriptase (RNA depentdent DNA polymerase) RNA DNA สลายส่วนที่เป็น RNA ออกไป โดย RNaseH DNA DNA

สรุป : ปัจจัยสำคัญที่ใช้ในการสังเคราะห์ DNA ใน prokaryote DNA REPLICATION สรุป : ปัจจัยสำคัญที่ใช้ในการสังเคราะห์ DNA ใน prokaryote DNA template dNTP : dATP, dGTP, dCTP และ dTTP RNA primer : - polyribonucleotide สายสั้นๆ - ใช้เป็นจุดเริ่มต้นการสังเคราะห์ DNA Enzyme และ protein ชนิดต่างๆ เช่น DNA polymerase, DNA ligase, DNA gyrase, primase, SSB, DnaC เป็นต้น พลังงาน (ในรูป ATP) ที่ใช้ในการคลายเกลียวและต่อสาย DNA

Telomere shortening and telomerase Telomere คือ DNA ส่วนที่อยู่ปลาย chromosome โดยทั่วไป DNA replication จะเกิดในทิศทาง 5’ 3’ เท่านั้น ดังนั้นเมื่อเกิด DNA replication ต่อไปเรื่อยๆ จะทำให้ปลาย chromosome ด้าน 5’ สั้นลงเรื่อย ๆ เรียกว่า telomere shortening ซึ่งอาจทำให้สูญเสีย gene ที่อยู่ใกล้ telomere

Area where gap is generated upon replication Parental Leading Parental Lagging New DNA 3' 5' 3' 5' 3' 5' 3' 5' การถอดแบบ DNA ของโครโมโซมที่เป็นเส้นตรงได้เป็นสาย DNA ใหม่ 2 สาย คือ สาย leading และ สาย lagging 36

37

Telomere shortening and telomerase Telomerase เป็น enzyme ที่ทำหน้าที่รักษา telomere ไม่ให้หดสั้นลง Telomerase ประกอบด้วย RNA oligonucleotide ที่ทำหน้าที่เป็น template และเอนไซม์ reverse transcriptase ที่สามารถสังเคราะห์ DNA จาก RNA ได้ ในบริเวณ telomere ของมนุษย์ จะมี tandem repeat ของ AGGGTT ซึ่ง telomerase จะเพิ่มส่วน tandem repeat เข้าไป เพื่อที่จะให้เป็น template ให้ primer เข้ามาจับ  ผลที่ได้ก็คือ DNA ที่สังเคราะห์ขึ้นมาจะมีความยาวเท่าเดิมหรือไม่หดสั้นลงเมื่อมี DNA replication

Short repeats making up telomere AGGGTT TCCCAA Parental strand Short repeats making up telomere 3' Newly synthesized lagging strand 1 Telomerase binds AGGGTT TCCCAA UCCCAA 2 Telomerase extends 3' end RNA template Telomerase reverse transcriptase New telomere repeat UCCCAA AGGGTT TCCCAA 3 Telomerase released Extended telomere permits completion of lagging strand AGGGTT TCCCAA UCCCAA 4 Primer is bound. DNA polymerase completes lagging strand Primer DNA polymerase

Telomere shortening and telomerase ในเซลล์บางชนิดที่ต้องมีการแบ่งตัวอย่างต่อเนื่อง เช่น germ cell จะมีเอนไซม์ telomerase ป้องกันการเกิด telomere shortening ส่วน somatic cell ไม่มี telomerase ดังนั้น เมื่อเซลล์ผ่านวงจรการแบ่งตัวมาถึงจุดหนึ่งที่ telomere สั้นลงมาก เซลล์นั้นก็จะแก่ และตาย ความผิดปกติในการทำงานของ telomerase ส่งผลให้เกิดโรคได้ เช่น การทำงานไปมาก telomerase ทำให้ cell ไม่ตายซึ่งพบได้ใน cancer cell บางชนิด ปัจจุบันมีการพัฒนาสารที่ยับยั้งการทำงานของ telomerase มาใช้รักษามะเร็งบางชนิด

DNA repair

Damage to DNA Force distortion, bending, breaking X-rays, γ -rays , ionized radicals activated oxygen ultraviolet light - thymine dimer intercalation, cross-link by foreign compound (some chemicals, drugs) accident of replication spontaneous decay of DNA (loss of base)

Mutation base substitution frameshift mutation ATC GAT TAA TA … T transition : Pu1 Pu2, Py1 Py2 transversion : Pu Py, Py Pu frameshift mutation deletion Insertion ATC GTA TTA ATA … ATC GAT TAA TA … ATC GTT ATT AAT A.. T

A T A T G C G C C A (G) C T (G) T A T A A T A T transition transversion A T A T G C G C C G C C T A T A A T A T insertion deletion

Gene mutation missense mutation : base substitution ทำให้ mRNA เปลี่ยนไป (รหัสของ amino acid เปลี่ยนแปลงไป) ทำให้โปรตีนผิดปกติ nonsense mutation : ถ้า codon ซึ่งเคย code ให้ amino acid เปลี่ยนไปเป็น stop codon ทำให้ได้ polypeptide สายสั้นลง อาจจะไม่สามารถทำหน้าที่ได้ (truncated polypeptide chain) silent mutation : mutation ไม่มีผลต่อ function ของ gene หรือยังคง code ให้ amino acid ตัวเดิม ทำให้โปรตีนชนิดเดิม เช่น AAA (Lys)  AAG (Lys)

Trinucleotide repeat expansion (triplet repeats) การเกิดขึ้นซ้ำ ๆ กันของ nucleotide 3 ตัว ที่พบบ่อยคือ CGG, CAG และ CTG Triplet repeat อาจอยู่ใกล้กับ gene หรืออยู่ใน gene มักทำให้เกิดโรคทางระบบประสาท ตัวอย่างโรคที่เกิดจาก triplet repeat ได้แก่ fragile-X symdrome, spinobulbar muscular dystrophy, myotonic dystrophy และ Huntington’s disease

Fragile-X syndrome เกิดจากความผิดปกติที่ FMR-1 gene คนปกติจะมีจำนวน triplet repeat CGG มากสุดประมาณ 50 copies แต่ในผู้ป่วยจะมีจำนวน copies มากกว่า 200 copies ทำให้เกิด mental retardation ผู้ป่วยที่มีจำนวน CGG copy repeat มาก จะมีอาการที่รุนแรงกว่าผู้ป่วยที่มีจำนวน copies น้อย

Fragile X syndrome

DNA repair เซลล์ทุกเซลล์จะมีระบบ DNA repair เนื่องจากขบวนการ DNA replication มีโอกาสที่จะเกิด mispaired base ขึ้นมาได้ โดยทั่วไป การซ่อมแซม DNA จะเริ่มต้นด้วยการตัด DNA ที่ผิดปกติออกไป จากนั้น DNA polymerase จะเติม nucleotide ใหม่เข้าไปโดยใช้ DNA ที่ปกติของอีกสายหนึ่งเป็น template แล้วปิดช่องว่างที่เหลือด้วย DNA ligase DNA repair systems : Mismatch repair Base-excision repair Nucleotide-excision repair Transcription-coupled repair

Common steps in DNA repair mechanisms. Normal DNA Damaged DNA Endo and exonucleases excinuclease P OH DNA with damaged region removed Nick Repaired DNA polymerase OH P DNA ligase Repaired DNA (normal) Common steps in DNA repair mechanisms.

Mismatch repair โดยทั่วไป DNA ที่เป็น parental strand จะมี methyl group เกาะที่เบส แต่ daughter strand จะยังไม่มีการเติม methyl group ที่เบสของมัน Daughter strand บริเวณที่มี mismatched base จะถูกตัดออกไปและมีการเติมเบสที่ถูกต้องเข้าไปแทน ตัวอย่างโรคที่เกิดจาก mutation ของ mismatch repair gene ได้แก่ hereditary nonpolyposis colorectal cancer

Mismatch repair methylated parental strand 3' 5' methylated parental strand unmethylated newly- synthesized strand DNA segment replaced

Base-excision repair ซ่อมแซมความผิดปกติของเบสที่ผิดไปเพียงหนึ่งเบส DNA glycosylase จะตัด N-glycosidic bond ที่เชื่อมระหว่างเบสที่ผิดปกติกับ deoxyribose ทำให้ขาดเบสที่ตำแหน่งนั้น เกิดเป็นช่องว่างเรียกว่า AP (apurinic หรือ apyrimidic) site AP endonuclease จะตัดสายที่มี sugar-phosphate ออก หลังจากนั้นจะใช้เอนไซม์อื่นมาซ่อมแซมบริเวณดังกล่าว

Nucleotide-excision repair การซ่อมแซมโดยใช้เอนไซม์ endonuclease ตัด DNA บริเวณที่ผิดปกติเกิดเป็นช่องว่าง แล้วอาศัยเอนไซม์อื่นซ่อมแซม เอนไซม์ที่สำคัญในขบวนการนี้มี 4 ชนิด คือ Uvr ABC exinuclease (excision nuclease : ตัดส่วนที่มีความผิดปกติออก), Uvr D (helicase : คลายเกลียว DNA), DNA polymerase I (เติม nucleotide โดยใช้ DNA อีกสายเป็น template) และ DNA ligase (เชื่อมปลายเข้าด้วยกัน) ตัวอย่างของความผิดปกติที่ใช้การซ่อมแซมวิธีนี้ คือ pyrimidine dimer

Repaired (normal) DNA Normal DNA Damage to bases glycosylase AP site nucleot Ide exci s ion repai r Damage to bases base excision repair glycosylase AP site incision endonuclease excision endonuclease AP site – Apurinic site – Apyrimidinic site DNA polymerase DNA ligase Repaired (normal) DNA

การเกิด thymine dimer (cyclobutane ring) เมื่อ DNA ถูกแสง UV P H O N deoxyribose N O H CH3 P H O N deoxyribose N O การเกิด thymine dimer (cyclobutane ring) เมื่อ DNA ถูกแสง UV H CH3 U.V. H O N deoxyribose N O H CH3 P H O N deoxyribose N O P H CH3

thymine dimer

Repair of thymine dimer 5' 3' 3' 5' excision of a 12 nt fragment by Uvr ABC excinuclease DNA synthesis by DNA polymerase 1 joined by DNA ligase

Transcription-coupled repair การซ่อมแซมความผิดปกติของ gene ในขณะที่มีการสังเคราะห์ mRNA RNA polymerase จะหยุดการทำงานเมื่อมันมาถึงบริเวณที่มีความผิดปกติของ DNA template จากนั้นโปรตีนที่ทำหน้าที่ excision repair จะซ่อมแซม DNA บริเวณนี้ เมื่อซ่อมแซมเสร็จแล้ว RNA polymerase จะทำงานต่อตามปกติ

Direct repair ^ การซ่อมแซม DNA โดยไม่ต้องตัดเบสหรือนิวคลีโอไทด์ออก พบใน bacteria ไม่พบในมนุษย์ ตัวอย่างได้แก่ การซ่อมแซม cyclobutane pyrimidine dimer โดยเอนไซม์ photolyase (photoreactivating enzyme) และ visible light ตัด dimer โดยไม่สลาย phosphodiester bond T A ^ photoreactivating enzyme (photolyase) and visible light

DNA repair defect ทำให้เกิดโรคทางพันธุกรรมได้หลายโรค Xeroderma pigmentosum Chromosomal breakage syndrome Bloom’s disease Fanconi anemia Progeria

Xeroderma pigmentosum Defect in excision repair (exinuclease) Prevalence 1 : 250,000 ผู้ป่วยจะไวต่อ UV light (UV light hypersensitivity) ผิวหนังของผู้ป่วยจะแห้ง (dry skin) อาจพบ skin atrophy, keratosis, ulceration และ skin carcinoma (cancer) ได้ ที่ตาอาจเกิด corneal ulcer (แผลที่ cornea) การป้องกัน : หลีกเลี่ยงการถูกแสง UV เช่น สวมเสื้อผ้ามิดชิด ใช้ครีมกันแดด ใช้แว่นกันแดด

RECOMBINATION REPAIR (post-replication repair) 5' DNA containing a pyrimidine dimer 3' 3' 5' Replication Damaged parental strand Gapped daughter strand Normal duplex DNA Recombination repair Damaged parental strand Repaired daughter strand Normal daughter strand Gapped parental strand Fill in and ligation DNA containing a pyrimidine dimer Normal duplex DNA