Genetic Engineering

Gene Engineering การสร้าง gene ใหม่ โดยตัดต่อระหว่าง DNA จากแหล่งที่ต่างกัน ได้ DNA โมเลกุลใหม่ เป็นโมเลกุลผสม เรียกว่า Recombinant DNA วิธีการทำหรือ methodology เรียกว่า Recombinant DNA technology หรือ Genetic engineering หรือ Gene cloning

I. หลักการ Recombinant DNA (Gene cloning) II. ส่วนประกอบในการทำ gene cloning III. การประยุกต์ใช้ Gene cloning

I. หลักการทำ Recombinant DNA 1. แยก DNA ของพาหะ และ DNA ที่ต้องการทำ cloning 2. ตัด DNA ของทั้ง 2 แหล่งด้วย Restriction endonuclease 3. ผสม DNA ทั้ง 2 แหล่ง กับ DNA ligase ภายใต้ เงื่อนใขให้ DNAs ต่อกัน --> ได้ Recombinant DNA หรือ Chimeric DNA

การสร้าง Recombinant DNA

II. ส่วนประกอบของการทำ Gene Cloning 1. Gene ที่ต้องการศึกษา เรียกว่า foreign DNA 2. DNA พาหะ เรียว่า Vector DNA 3. Restriction endonuclease 4. DNA ligase ต่อระหว่าง 2 nucleotides 5. Host cells สำหรับ recombinant DNA เพื่อเพิ่มจำนวนในขั้นต้นของกระบวนการ ที่พัฒนาใช้ได้แล้วมี bacteria บางชนิด และ yeast

ขั้นตอนละเอียดในการทำ Gene cloning 1. เลือก DNA โมเลกุลที่ต้องการ clone เรียกว่า Foreign DNA และเลือก DNA โมเลกุลที่นำหน้าที่เป็นพาหะ เรียกว่า Vector DNA ตัด foreign DNA และ ตัด vector DNA ด้วย enzyme ชนิดเดียวกัน Enzyme ที่ใช้เรียกว่า Restriction enzyme (แยกคนละหลอด)

2. เลือกท่อน (fragment) ของ cut foreign DNA ขนาดพอเหมาะที่จะ clone โดย แยก DNA ในแผ่นวุ้น ใน สนามไฟฟ้า เรียกวิธีนี้ว่า Electrophoresis ซึ่ง DNA จะถูกออกจากกันตามขนาดความยาว ได้ปรากฏเป็นแถบ (bands) ต่าง ๆ กัน ตัดและแยกแถบที่ต้องการออกมาสกัดแยก DNA ท่อน (fragment) ที่ต้องการ

DNA gel electrophoresis สำหรับแยกชิ้นส่วน DNA

3. Insert DNA fragment เข้าไปในโมเลกุลของ cut vector DNA ด้วย enzyme Ligase จะได้ DNA ผสมโมเลกุลใหม่ เรียกว่า Chimeric DNA หรือ Recombinant DNA 4. นำ Recombinant DNA เข้าไปใน host cells ของ cloning vector โดยวิธี Transformation หรือ วิธีอื่น ๆ host cells โดยทั่วไปใช้ E. coli และ yeast 5. Recombinant DNA ภายใน host จะแบ่งตัวเพิ่มจำนวน เรียกว่า Amplification และถ่ายทอดไปพร้อมกับการแบ่งตัวเพิ่มจำนวนของ host ทำให้ได้ identical copies หรือ clones ของ recombinant DNA จำนวนมาก

หลักการพื้นฐานของ Gene cloning Clone หมายถึง ประชากร (copy) ที่เหมือนกันของสิ่งมีชีวิตหรือ โมเลกุล

6. ทำการตรวจเลือกหา (screening) host cells มี recombinant DNA

Cloning Vectors 1. Plasmid 2. Bacteriophage 3. Cosmid 4. Phagemid 5. Artificial chromosome

1. Plasmid vectors Plasmids เป็น extrachromosome ใน microorganisms โดยเฉพาะ bacteria เป็น double-stranded circular โมเลกุล ขนาด ~ 1 kb (1 kb = 1000 bp) ถึง 200 kb มี antibiotic-resistant genes ที่สามารถใช้เป็น markers สำหรับคัดเลือก clones ที่ positive pBR322 เป็น plasmid ตัวแรกที่ใช้ใน cloning

1.1 Plasmid pBR322 ขนาด 4.3 Kb มี Ampicillin resisteant gene Tetracyclin resistant gene มี restriction sites มากและ ง่ายต่อการใช้ทำ cloning เช่น EcoRI, PstI, BamHI มี Origin of replication เป็น cloning vector ใน prokaryote นำเข้า bacteria โดย Transformation

Bacterial cloning โดยใช้ plasmid pBR322

1.2 Yeast episomal plasmids / YEps ดัดแปลงจาก 2 um plasmid (พิเศษ) ของ yeast ขนาด 6 kb มี resistant gene ต่อ inhibitors เช่น copper และ methotrexate marker คือ leu2 gene ใช้เป็น cloning vector ใน eukaryote Transform yeast

Yeast cloning โดยใช้ plasmid ที่มี LEU2 gene เป็น marker

1.3 Ti plasmid Ti plasmid หรือ T-DNA ใน Agrobacterium tumefaciens ในดิน integrate เข้า plant chromosomal DNA ทำให้เกิดเนื้องอกในพืช (callus) หรือ cancer growth หรือ crown gall ในพืช

Gene cloning โดยใช้ Ti plasmid เพื่อให้ T-DNA (tumor DNA) ใน bacteria infect (แทรก) เข้า chromosome ของพืช --> crown gall --> ชักนำให้เจริญเป็นต้นพืช

2. Bacteriophage vectors Double-stranded virus ที่บางระยะของวงจรชีวิตอยู่ในรูป Linear duplex ส่วนมากใช้ Bacteriophage Lambda (l) ขนาด ~ 50 kb l มี genes ~ 50 % อยู่ 2 ข้างของ linear duplex ที่จำเป็นต่อ growth บริเวณกลางไม่จำเป็นต่อ growth สามารถตัดออกได้ l package DNA ให้เป็น circular form ได้ 78-105 %

การใช้ phage l เป็น cloning vector ส่วนกลางเป็นส่วนที่ไม่จำเป็นในการดำรงชีพของ phage จึงสามารถเอา foreign DNA ใส่เข้าไปแทนได้ cos cos

ใน Linear duplex ที่บริเวณปลายสุดทั้ง 2 ข้างของเส้นเป็นช่วง Single strand ขนาด 12 nucleotides เรียกว่า Cohesive ends หรือ COS sites Cos sites ทำ complementary ต่อกัน ให้ได้ circular duplex DNA ก่อน pack เข้า capsule กลายเป็น bacteriophage ใหม่ l vector รับ insert ได้ 12-25 % จึงเหมาะสำหรับในการทำ cloning ของ eukaryotic genes ซึ่งส่วนมีขนาดใหญ่ เช่น ใช้ทำ Genomic library

2.2 M13 vector Single-stranded phage รับ insert ที่เป็น single-stranded DNA ระหว่าง 300-1000 bases Rolling circle replication ให้ double strand ออกจาก bacteria ในรูป single strand เหมาะสำหรับใช้ cloning เพื่อ sequence DNA

3. Cosmid vector Vector ที่สร้าง (construct) จากส่วนของ 1. Plasmid : drug-resistant marker, origin of replication และ restriction sites จึงมี replication ได้เหมือน plasmid 2. Phage : cos sites สำหรับ packaging cloned DNA ให้เป็น phage chromosome ใน in vtro

cosmid มีขนาด 4-6 kb construct ให้มี polycloning site cosmid สามารถรับ insert foreign DNA ได้ระหว่าง 35 - 50 kb เหมาะในการ clone gene ขนาดใหญ่ของ eukaryote

4. Pagemid vector Vector ที่ construct ให้มี คุณลักษณะคล้าย cosmid คือ มีทั้งลักษณะของ phage และ plasmid มี multiple cloning site insert เข้าที่ lacZ gene มี origin of replication จาก single-stranded f1 คล้าย M13 ทำให้ package ได้ single-stranded phagemid DNA

Bluescript vector / pBS ใช้เป็น Transcription vector มี Multiple cloning site มี 2 promoters คือ T3 promoter ข้างหนึ่ง และ T7 promoter อีกข้างหนึ่ง สามารถ transcribe RNA ใน in vitro ใช้ศึกษา translation in vitro

5. Artificial chromosome เป็น Construct เพี่อทำ cloning ใน yeast เรียกว่า Yeast Artificial chromosome / YAC เป็น mini-chromosome ประกอบด้วย 1 centromere, 2 telomeres, origin of replication, และ seletable marker gene(s) ใช้ศึกษา chromosome segregation ระหว่าง meiosis และ cloning DNA ขนาดใหญ่ได้ถึง 150 kb

Yeast Artificial chromosome / YAC

Restriction Endonuclease recognize specific nucleotide sequences ตัดระหว่าง 4-8 nucleotide ลำดับเฉพาะแต่ละชนิด

Resstriction enzymes ตัด DNA ให้ปลาย 2 แบบ Blunt end Sticky end

DNA ligase เชื่อมต่อระหว่าง 2 nucleotide ของ 2 DNA โมเลกุล Sticky ends : efficiency ค่อนข้างดี Blunt ends : efficiency น้อยกว่า

DNA Library

DNA library คือ ห้องสมุด หรือ sets ของ cloned DNA ใน vectors ที่เก็บไว้ทั้งหมดใน host cells เพื่อใช้ตรวจหาและศึกษา genes ภายหลัง แบ่งเป็น 3 ประเภท 1. Genomic DNA library : ห้องสมุด cloned DNA ของ 1 genome ซึ่งคือ genes ทั้งหมดของ สิ่งมีชีวิตใด ๆ เช่น human genome library 2. cDNA library : ห้องสมุด cloned cDNA ของ structural gene ใด ๆ 3. Chromosome-specific DNA library : ห้องสมุด cloned DNA ของ 1 chromosome

Gene Recombinant Technology การประยุกต์ใช้ Gene Recombinant Technology

Application ของ Gene Recombinant Technology 1. Physical maps / restriction maps of DNA molecule หาแผนผังตำแหน่งของ gene บน chromosomes 2. Nucleotide sequences of gene หาลำดับ base ของ gene 3. In vitro site-specific mutagenesis ศึกษาการทำงาน และการควบคุมของ genes โดย การทำ mutation เฉพาะ base(s)

4. Identification of genes ชี้บอก gene และรายละเอียดของ gene เช่น gene ที่ทำให้เป็นโรค 5. Human gene therapy รักษาโรคทางพันธุกรรม โดยหลังวิเคราะห์ได้ว่า gene ใดเป็นเหตุของโรค นำ gene หรือผลผลิต (protein) ของ gene นั้นใส่หรือใช้ทดแทน ป้องกันโดยไม่ให้ gene(s) เป็นสาเหตุของโรครุนแรงถ่ายถอด

6. Production of proteins 104203 : Gene Manipulation 6. Production of proteins ผลิต proteins, hormones และ enzymes ใช้ bacteria ซึ่งเป็น host ของ recombinant DNA เป็นผู้ผลิตให้ โดยไม่ต้องสกัดจากสิ่งมีชีวิตชั้นสูงโดยเฉพาะสัตว์ 7. Transgenic organisms (plants & animals) หรือ GMO (Gene modified organism) crown gall, herbicide และ insecticide resistant plants เช่น ข้าว ข้าวโพด ถั่วเหลือง มะเขือเทศ มันฝรั่ง หนู (ทดลอง) ฯลฯ 9. Paternity tests & forensic application DNA fingerprints หาความเป็นพ่อ-แม่ หาคนร้าย รศ.ดร. กรกช อินทราพิเชฐ

ตัวอย่างการประยุกต์ใช้ Gene Recombinant Technology 104203 : Gene Manipulation ตัวอย่างการประยุกต์ใช้ Gene Recombinant Technology รศ.ดร. กรกช อินทราพิเชฐ

Genetic Maps

DNA Sequencing

Cloning Growth Hormone Gene

Gene Therapy : รักษาโรคทางพันธุกรรม

การเตรียมฉีด DNA ด้วย microinjection เข้าไปในไข่ Transgenic Animal การเตรียมฉีด DNA ด้วย microinjection เข้าไปในไข่ Transgenic mouse (ซ้าย)

Transgenic Plants Luciferase plant พืชเรืองแสง Glyphosate-tolerant petunia

DNA Fingerprintings : Identify บุคคล / พ่อ-แม่

หาคนร้ายจากผู้ต้องสงสัย หาพ่อ - แม่

Cell Cloning ให้เป็น cloned animal 2. Fuse รวมกับ unfertilized egg ที่ ได้เอา nucleus ออกแล้ว 3. กระตุ้นให้แบ่งเซลล์ กลายเป็นตัวอ่อน (embryo) 4. นำฝากใส่มดลูกของสัตว์ ตัวเมียที่พร้อมตั้งครรภ์l