การเตรียมความพร้อมสำหรับงานวิจัยที่ใช้เทคนิค recombinant DNA รศ.ดร.เพชรรัตน์ ธรรมเบญจพล การประชุมคณะกรรมการความปลอดภัยทางชีวภาพระดับสถาบันภูมิภาค ประจำปี 2551: ครั้งที่ 1 ภูมิภาคตะวันออกเฉียงเหนือ วันที่ 8 สิงหาคม 2551 ณ ห้องรับขวัญ ชั้น 3 อาคารขวัญมอ มหาวิทยาลัยขอนแก่น

Basic steps in gene cloning 1. นำชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่มียีนหรือส่วนที่ต้องการเข้าไปเชื่อมต่อกับโมเลกุลของดีเอ็นเอพาหะ (vector) ได้เป็นโมเลกุลดีเอ็นเอสายผสม (recombinant DNA molecule) 2. ส่ง recombinant DNA molecule เข้าไปในเซลล์อาศัย (host cell) 3. ส่วนของ recombinant DNA molecules เพิ่มปริมาณใน host cell เป็นจำนวนมาก(มีหลาย copy) 4. เมื่อ host cell แบ่งตัวเองเพิ่มปริมาณ ส่วนของ recombinant DNA molecule จะถูกส่งถ่ายออกไปในเซลล์ใหม่และเพิ่มปริมาณในเซลล์ใหม่ได้เหมือนเดิม 5. สุดท้ายจะได้กลุ่มเซลล์ที่เหมือนๆ กัน(โคโลนี) เรียกว่า โคลน แต่ละเซลล์ของโคลนใดโคลนหนึ่งจะมีส่วนของ recombinant DNA moleculesที่เหมือนกัน

ขั้นตอนของการปรับปรุงพันธุ์พืชโดยพันธุวิศวกรรม 1. เลือกชนิดพืชที่ต้องการปรับปรุง / ระบบเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช 2. เลือกยีนที่เกี่ยวข้องกับลักษณะที่ต้องการปรับปรุง - gene cloning, - nucleotide sequencing, - manipulating of gene into plant expression vector 3. เลือกวิธีการส่งถ่ายยีน(gene gun, Agrobacterium-mediated) 4. การคัดเลือกและตรวจสอบ transgenic plant (lab., greenhouse) 5. การทดสอบ performance ของ transgenic plant in field condition, property of target character (field trial, bioassay) 6. ทดสอบ biosafety for environment, human health, ecology, etc. 7. Releasing for growing in open field, commercial scale.

การเตรียมความพร้อมสำหรับงานวิจัยที่ใช้เทคนิค recombinant DNA สถาบันการศึกษา วิจัยสร้างผลงาน -องค์ความรู้ -ผลิตภัณฑ์ นวัตกรรม ผลิตบุคลากรด้านเทคโนโลยีชีวภาพให้กับประเทศชาติ

ขอบเขตของงานวิจัยด้าน Recombinant DNA 1. การเตรียมตัวอย่างดีเอ็นเอ 2. การจัดการตัดต่อดีเอ็นเอ 3. การส่งถ่ายดีเอ็นเอสายผสมเข้าสู่เซลล์อาศัย (host cell) 4. การตรวจสอบว่ามีดีเอ็นเอสายผสมเกิดขึ้น 5. การเก็บรักษาโคลน( recombinant clone)

สิ่งเกี่ยวข้องที่สำคัญ วิธีการปฏิบัติงาน (คู่มือการปฏิบัติงาน สมุดบันทึกการทำงาน) วัสดุ สารเคมี เครื่องมือขนาดเล็ก เครื่องมือขนาดใหญ่ สถานที่ (ห้องปฏิบัติการ, โรงเรือนปลูกพืชทดลอง) เจ้าหน้าที่ หัวหน้าห้องปฏิบัติการ ผู้ปฏิบัติการวิจัย ผู้ช่วยอื่นๆ (ฝ่ายสนับสนุน) ผู้เข้ามารับบริการในรูปแบบต่างๆ (นักศึกษาฝึกงาน ดูงาน ฯลฯ) ฝ่ายตรวจสอบมาตรฐานต่างๆ(ภายใน,ภายนอก)

(คู่มือปฏิบัติการ, สมุดบันทึกการทำงาน) วิธีการปฏิบัติงาน (คู่มือปฏิบัติการ, สมุดบันทึกการทำงาน) Buffer /Reagent Preparations DNA extraction Agarose gel electrophoresis DNA ligation Screening for recombinant DNA Etc. แผนที่นำทางสู่ความสำเร็จ เอกสารอ้างอิง ควรมีรูปแบบมาตรฐานในการจดบันทึกงาน

วัสดุอุปกรณ์ในงานวิจัย Glass ware Plastic ware Metalic ware วัสดุวิทยาศาสตร์ วัสดุเกษตร วัสดุสำนักงาน เครื่องมือต่างๆ ต้องรู้จักคุณสมบัติพื้นฐาน ทราบวิธีการใช้งานที่ถูกต้อง ทราบวิธีการเก็บรักษา การดูแลก่อนและหลังการใช้งานให้เหมาะสม

เครื่องมือพื้นฐาน :อุปกรณ์ฆ่าเชื้อจุลินทรีย์ - ระบบความร้อนชื้น (Autoclave) - ระบบความร้อนแห้ง (Hot air oven) ตะเกียงแอลกอฮอล์ ตู้ที่มีหลอด ultraviolet ชุดกรองเชื้อจุลินทรีย์ ( filter membrane)

เครื่องมือพื้นฐาน :เครื่องชั่งสาร (balance) เครื่องชั่งหยาบ เครื่องชั่งละเอียด (2, 3, 4 ตำแหน่ง) วัสดุอุปกรณ์สำหรับชั่งสาร - spatula - ถาดรองสารเคมี - กระดาษรองชั่งสารเคมี งานทั่วไป งานด้านชีวโมเลกุล

เครื่องมือพื้นฐาน : การเตรียมบัพเฟอร์ เตรียมอาหารเลี้ยงเชื้อจุลินทรีย์ pH meter Mixer Hot plate เตาแก๊สหุงต้ม Fume hood

เครื่องมือพื้นฐาน : การสกัดดีเอ็นเอ microcentrifuge ultracentrifuge High speed centrifuge ใช้แยกสารชีวโมเลกุลโดยแรงปั่นเหวี่ยง Benchtop refrigerate microcentrifuge

เครื่องมือพื้นฐาน : ตรวจสอบคุณภาพ DNA/RNA/Protein Gel electrophoresis apparatus (Horizontal, Vertical) Spectrophotometer (UV/visible) Gel documentation

เครื่องมือพื้นฐาน : เก็บรักษาสภาพ Sample, DNA,RNA, protein, recombinant clones, buffers, reagents 4oC, -20oC, (-70oC)

เครื่องมือพื้นฐาน: เครื่องมือดูดสารละลาย เครื่องมือดูดสารละลายปริมาตรต่ำ (Micropipettes) Multi-channel Micropipette Pasture pipette, Pipette

เครื่องมือพื้นฐาน: ตู้ย้ายเชื้อจุลินทรีย์ Clean Bench ลมเป่าจากบนลงล่าง ลมเป่าออกด้านหน้า ระดับความปลอดภัยทางชีวภาพของงานวิจัยด้านจุลินทรีย์กำหนดรูปแบบของตู้ย้ายเชื้อจุลินทรีย์ที่บังคับใช้ Larminar Flow

เครื่องมือพื้นฐาน: การเพาะเลี้ยงเชื้อจุลินทรีย์ ตู้บ่มเชื้อ (incubator) เครื่องเขย่าเพาะเลี้ยงเชื้อ (shaker incubator) Rotary shaker Waterbath shaker

เครื่องมือเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอในหลอดทดลอง (PCR) Thermal cycler (พื้นฐาน) Realtime-PCR

เครื่องมือพื้นฐาน: งาน Nucleic acid hybridization Synthesis DNA probe Hybridization Detection Hybridization oven

Southern blot hybridization ผลการตรวจ DNA พืช /Hind III cut 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 สัญญาณไฮบริไดซ์กับ DNA probe ก่อนย้ายลงเมมเบรน หลังย้ายลงเมมเบรน งานด้าน Nucleic acid hybridization

ประเภทสารเคมี 5. เอนไซม์ 1. สารเคมีปรกติ ไม่อันตราย 2. สารไวไฟ/ จุดระเบิดได้ 3. สารมีฤทธิ์กัด กร่อน : กรด ด่าง phenol 4. สารที่ก่อให้เกิดการเปลี่ยนแปลงทางพันธุกรรม (mutagen, carcinogen) เช่นethidium bromide 5. เอนไซม์

Agarose gel electrophoresis Agarose gel = matrix for separation DNA molecules

- ระบบการจัดเก็บสารเคมีที่ถูกต้อง สะดวก สิ่งควรทำ - การเลือกใช้สารเคมีให้เหมาะสม - ความเข้าใจในสลากกำกับข้างขวด - ระบบการจัดเก็บสารเคมีที่ถูกต้อง สะดวก - ระบบการบันทึกการใช้สารเคมี - ระบบการตรวจสอบคุณภาพ/ อายุการใช้งานของสารเคมี

เลือกให้เหมาะสมกับงาน น้ำ : คุณภาพน้ำ น้ำก๊อก น้ำกรอง น้ำกลั่น น้ำปลอดอิออน น้ำ RO เลือกให้เหมาะสมกับงาน

มาตรการประหยัดพลังงาน ระบบไฟฟ้า เพียงพอสำหรับเครื่องมือต่างๆ ไฟแสงสว่าง ควรมีระบบไฟฉุกเฉิน ไฟสำรอง เหมาะสมกับกำลังการใช้ไฟฟ้าของเครื่องมือ - ไฟ 2 phase, 3 phase - 110 volts, 220 volts 4. ระบบป้องกันภัยจากไฟฟ้าลัดวงจร มาตรการประหยัดพลังงาน

ระบบการจัดการของเสีย วัสดุสิ่งของที่ใช้แล้ว (ขยะปรกติ ขยะอันตรายที่มีการปนเปื้อนสารเคมีอันตราย เชื้อจุลินทรีย์อันตราย ขยะที่ระเบิดได้ ฯลฯ) สารเคมีที่ใช้แล้ว (สารเคมีปรกติ สารเคมีเป็นอันตรายต่อสุขภาพ สารเคมีอันตรายต่อสภาพแวดล้อม) ระบบควบคุมภายในห้องปฏิบัติการ ระบบควบคุมจากหน่วยงานสังกัด ระบบควบคุมจากหน่วยงานภายนอก

สถานที่ (ห้องปฏิบัติการ) เหมาะสมกับลักษณะของงาน ปลอดภัยสำหรับผู้ปฏิบัติการ/ ผู้ที่เกี่ยวข้อง สิ่งสำคัญ การจัดระบบปฏิบัติงานต่างๆ การบริหารจัดการห้อง lab ปรึกษาผู้เชี่ยวชาญด้านการออกแบบห้องปฏิบัติการ

นักวิจัย/เจ้าหน้าที่/ ผู้ใช้ห้องปฏิบัติการ ความชำนาญ เชี่ยวชาญ จิตสำนึกด้านความปลอดภัยในการปฏิบัติงาน ประหยัดทรัพยากร รักษาสภาพแวดล้อม

ฝ่ายตรวจสอบมาตรฐานต่างๆ(ภายใน,ภายนอก) - การจัดระดับห้องปฏิบัติการ - มาตรการด้านความปลอดภัยทั่วไป มาตรการด้านความปลอดภัยทางชีวภาพ - มาตรฐานในการดำเนินงานตามกิจกรรมหลักของห้องปฏิบัติการ/หน่วยงาน (ความน่าเชื่อถือ การยอมรับในระดับสากล) = ระบบ ISO

การเตรียมความพร้อมสำหรับงานวิจัยที่ใช้เทคนิค recombinant DNA Infrastructure Researcher /Technical staffs Research budget Maintenance cost

บทบาทของ IBC ? 1. ดูแลเฉพาะเรื่องความปลอดภัยทางชีวภาพ (สิ่งมีชีวิตดัดแปลงพันธุกรรม) ตามภาระหน้าที่ที่ได้รับมอบหมายจาก NBC 2. รับผิดชอบในข้อ 1 + ตรวจสอบระบบมาตรฐานความปลอดภัยของห้องปฏิบัติการเทคโนโลยีชีวภาพ

ขอบคุณ

สิ่งที่ควรผลักดันเพื่อให้งานวิจัยดำเนินไปได้อย่างมีมาตรฐานสากล 1. วิสัยทัศน์ของผู้บริหารองค์กร 2. งบประมาณสนับสนุนการดำเนินงานด้านการควบคุมมาตรฐานต่างๆ ที่เกี่ยวข้องกับงานวิจัย การเรียนการสอนที่เกี่ยวข้อง โครงสร้างพื้นฐาน สถานที่ วัสดุอุปกรณ์ ฯลฯ บุคลากร เครือข่าย/ ระบบงานต่าง ๆที่สัมพันธ์กัน

กฏเกณฑ์กติกาที่เกี่ยวข้อง การค้าระหว่างประเทศ (FTA) ภาคีสัญญาระหว่างประเทศ : พิธีสารคาตาเฮน่า HACCP WTO มาตรฐานสากล มาตรฐานระดับประเทศ มาตรฐานความปลอดภัยในห้องปฏิบัติการ มาตรฐานความปลอดภัยต่อสังคม สิ่งแวดล้อม ฯลฯ ISO มาตรการสุขอนามัยพืช มาตรฐานสินค้าเกษตรและอาหารแห่งชาติ พรบ.กักพืช (กรมวิชาการเกษตร) (ร่าง) พรบ.ความปลอดภัยทางชีวภาพของเทคโนโลยีชีวภาพสมัยใหม่

5 ส เพื่อความปลอดภัย สะสาง (Seiri 整理) จัดแยกสิ่งของที่จำเป็นต้องใช้ และกำจัดสิ่งของที่ไม่จำเป็นต้องใช้ออกไป สะดวก (Seiton 整頓) จัดวางสิ่งของที่จำเป็นต้องใช้ไห้เป็นระเบียบ สะดวกต่อการนำมาใช้ และเก็บเข้าที่ สะอาด (Seiso 清楚) จัดระเบียบการดูแลความสะอาดของสถานที่ทำงาน พื้นที่ทางเดินให้ปราศจากขยะ ฝุ่นผง และเศษวัสดุอยู่เสมอ สุขลักษณะ (Seiketsu 清潔) จัดของให้เป็นระเบียบเรียบร้อยวางในตำแหน่งที่ควรอยู่ และรักษาสภาพแวดล้อม สถานที่ทำงานให้สะอาดเรียบร้อย สร้างนิสัย (Shitsuke 躾) ดำเนินงานในเรื่องสะสาง สะดวก สะอาด สุขลักษณะ อย่างต่อเนื่องจนเป็นนิสัย

การดูแลความปลอดภัยในห้องปฏิบัติการ โครงการอบรม เรื่อง ความรู้เกี่ยวกับสารเคมีเบื้องต้นและการดูแลความปลอดภัยในห้องปฏิบัติการ การดูแลความปลอดภัยในห้องปฏิบัติการ วันพฤหัสบดีที่ 3 เมษายน 2551 ณ ห้อง 308 ชั้น 3 อาคารมหามกุฏ ประเสริฐ เรียบร้อยเจริญ ภาควิชาเคมีเทคนิค คณะวิทยาศาสตร์

การจัดการห้องปฏิบัติการ:จะเริ่มอย่างไร??? 1. จัดทำคู่มือความปลอดภัย 2. ประเมินเบื้องต้น -รายการเครื่องมือและอุปกรณ์ต่างๆ -รายการสารเคมีและปริมาณ -รายการอุปกรณ์เพื่อความปลอดภัย (ตู้ยา เครื่องดับเพลิง อ่างล้างตา และที่ล้างตัวฉุกเฉิน) 2. จัดทำแผนผังห้องปฏิบัติการ พร้อมทั้งการประเมินความเหมาะสม และแก้ไข 3. ประเมินละเอียด โดยการตรวจสอบความปลอดภัยต่างๆ ตาม Check list ที่เหมาะสม -ความสะอาด กลิ่น -การจัดวางเครื่องมือ -ทางออก ทางเดิน -อื่นๆ 4. จัดทำแผนฉุกเฉิน ในการระงับเหตุ

การจัดทำคู่มือความปลอดภัย กำหนดทีมงาน กำหนดข้อปฏิบัติต่างๆ ข้อปฏิบัติของนิสิต ระเบียบเพื่อความปลอดภัย .... ความรู้เบื้องต้นต่างๆ สารเคมี การระงับเหตุ อัคคีภัย อื่นๆ ตามความเหมาะสม

(ร่าง) พระราชบัญญัติว่าด้วยความปลอดภัยทางชีวภาพของเทคโนโลยีชีวภาพสมัยใหม่ พ.ศ.... (ฉบับแก้ไขเดือนเมษายน ๒๕๕๐) บรรยายโดย อาจารย์ เศรษฐบุตร อิทธิธรรมวินิจ คณะเศรษฐศาสตร์ มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์ และ ดร. วิเทศ ศรีเนตร สำนักงานนโยบายและแผนทรัพยากรธรรมชาติและสิ่งแวดล้อม

1.การนำเข้าและส่งออก ม.๑๙-๒๔ โครงสร้าง (ร่าง) พระราชบัญญัติว่าด้วยความปลอดภัยทางชีวภาพ ของเทคโนโลยีชีวภาพสมัยใหม่ พ.ศ.... (Structure of draft Biosafety Act) ข้อกำหนดทั่วไป (General Provisions) ข้อกำหนดที่ใช้ในการดำเนินการ (Operational Provisions) ข้อกำหนดเสริมและสนับสนุน (Supportive Provisions) 1.การนำเข้าและส่งออก ม.๑๙-๒๔ 1. กองทุนความปลอดภัยทาง ชีวภาพ ม.๗๑-๗๕ ๑ .หลักการและเหตุผล 2. การใช้ในสภาพควบคุม ม.๒๕-๓๑ 2. พนักงานเจ้าหน้าที่ ม.๗๖-๘๐ ๒. ขอบเขต ม.๔, ม.๕ 3. การใช้ในการทดลองภาคสนามสภาพจำกัด ม.๓๒-๓๖ 3. การอุทธรณ์ ม.๘๑-๘๒ ๓. นิยาม ม.๓ 4. การปลดปล่อยสู่สิ่งแวดล้อมโดยจงใจ ม.๓๗ - ๔๖ 4. ความรับผิดและการชดใช้ความเสียหาย ม.๘๓ - ๙๐ 5. การจำหน่ายเพื่อเป็นอาหาร หรืออาหารสัตว์ และการใช้เพื่อการผลิต ม.๔๗ - ๕๓ ๔. คณะกรรมการ และหน่วยงานผู้รับผิดชอบ ม.๗-๑๘ 6. การพักใช้ การเพิกถอนใบอนุญาต และการเลิกประกอบกิจการตามใบอนุญาต ม.๕๔-๖๐ 5. บทกำหนดโทษ ม.๙๑-๑๐๘ 7. การดูแล ขนส่ง เคลื่อนย้าย เก็บรักษา บรรจุหีบห่อและชี้จำแนก ม. ๖๑-๖๒ 6. บทเฉพาะกาล ม.๑๐๙-๑๑๐ 8. เหตุฉุกเฉินและการปลดปล่อยโดยไม่จงใจ ม.๖๓ - ๖๕ 9. การรับฟังความคิดเห็นของประชาชน การเปิดเผยและการปกปิดข้อมูล ม.๖๖-๗๐ (Unintentional Release and Emergency)

Recombinant E. coli การวิเคราะห์ขนาด plasmid DNA Recombinant E. coli ด้วยวิธี alkaline lysis ตรวจสอบบน 1% agarose gel Recombinant E. coli 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Insert cDNA TMV CGMMV-me25