งานนำเสนอกำลังจะดาวน์โหลด โปรดรอ

งานนำเสนอกำลังจะดาวน์โหลด โปรดรอ

LAB : PROTEIN CHEMISTRY JUN 27 th, 2014 RUJIRA PATANAWANITKUL, M.D. CHAIYAWAT SUPPASILP, M.D. ASSOCIATE PROFESSOR NEDNAPIS TIRAWANCHAI, Ph.D.

งานนำเสนอที่คล้ายกัน


งานนำเสนอเรื่อง: "LAB : PROTEIN CHEMISTRY JUN 27 th, 2014 RUJIRA PATANAWANITKUL, M.D. CHAIYAWAT SUPPASILP, M.D. ASSOCIATE PROFESSOR NEDNAPIS TIRAWANCHAI, Ph.D."— ใบสำเนางานนำเสนอ:

1 LAB : PROTEIN CHEMISTRY JUN 27 th, 2014 RUJIRA PATANAWANITKUL, M.D. CHAIYAWAT SUPPASILP, M.D. ASSOCIATE PROFESSOR NEDNAPIS TIRAWANCHAI, Ph.D.

2 วัตถุประสงค์ Amino acid Peptides & proteins  เพื่อทดสอบกรดอะมิโนและโปรตีนโดยอาศัยคุณสมบัติ ทางเคมีที่จำเพาะ  เพื่อศึกษาคุณสมบัติโปรตีน เช่น การละลาย, Isoelectric point และ การเสียสภาพธรรมชาติ

3 การทดลองที่ 1  การทดสอบกรดอะมิโนและโปรตีนในสารตัวอย่าง 1.1 การทดสอบ Ninhydrin 1.2 การทดสอบ Biuret

4 1.1 การทดสอบ Ninhydrin Ninhydrin เป็นสารไม่มีสี ทำปฏิกิริยากับสารที่มีกลุ่ม อะมิโนเสรี ได้เป็นสารสีม่วง สารที่ให้ผลบวก : ninhydrin free amino group of amino acid or protein amino acid, protein, amine

5 1.1 การทดสอบ Ninhydrin การแปลผล : ผลบวกจะได้สารละลายสีม่วง แต่ถ้าเป็น proline หรือ hydroxyproline (2 o amine) จะได้สารละลายสีเหลือง amino acid “Proline” “ Hydroxyproline” Negative Positive Positive (proline)

6 1.1 การทดสอบ Ninhydrin Fingerprints: using Ninhydrin

7 1.1 การทดสอบ Ninhydrin สารตัวอย่าง 15 หยด + Ninhydrin 2 หยด ผสมให้เข้ากัน แล้วแช่ในน้ำเดือด 2 นาที Distilled water GlycineProlineAlbuminGlobulin ลักษณะของ สารละลาย

8 1.2 การทดสอบ Biuret น้ำยา biuret ประกอบด้วย Cu ++ ในสารละลายที่เป็นด่าง เมื่อทำปฏิกิริยากับสารที่มี peptide bond ในอณู ตั้งแต่ 2 bonds ขึ้นไปจะได้ complex สีม่วง Peptide bond Biuret reagent (Cu ++ in alkaline solution) + polypeptide

9 1.2 การทดสอบ Biuret สารตัวอย่าง 5 หยด + น้ำยา Biuret 1 mL ผสมให้เข้ากัน แล้วสังเกตสีของสารละลาย Distilled water GlycineProlineAlbuminGlobulin ลักษณะของ สารละลาย

10 การทดลองที่ 2 - การตกตะกอนโปรตีน โปรตีนเป็นสารที่มีขนาดอณูใหญ่และละลายอยู่ในรูปของ Colloid การละลายของโปรตีนมีความสำคัญและจำเป็นต่อการทำงานของ โปรตีน การละลายของโปรตีนในสารละลายที่เป็นน้ำขึ้นกับปัจจัยหลายชนิด เช่น pH ของสารละลาย, อุณหภูมิ, ประจุสุทธิของโปรตีน หรือ ชนิด ของโปรตีนซึ่งจะมีจำนวนหมู่ที่มีความสัมพรรค (affinity) กับน้ำ (เช่น -NH 3 +, -COO -, -SH, =N + H-, -OH) แตกต่างกัน

11 การทดลองที่ 2 - การตกตะกอนโปรตีน ในการทดลองนี้นักศึกษาจะได้ทดลองเกี่ยวกับปัจจัยต่างๆที่มีผลต่อ การละลายของโปรตีน 2.1 การปรับ pH ไปที่ isoelectric point 2.2 การตกตะกอนด้วย ammonium sulfate 2.3 การแข็งเป็นลิ่มด้วยความร้อน 2.4 การตกตะกอนด้วย protein precipitating agents 2.5 การกลับมาละลายได้ใหม่ของโปรตีน

12 การทดลองที่ 2 - การตกตะกอนโปรตีน

13 การทดลองที่ 2 - การตกตะกอนโปรตีน 2.1 การปรับ pH ไปที่ isoelectric point ประจุของโปรตีนส่วนใหญ่มาจากสายข้างที่แตกตัวได้ของ amino acid residues และ ปลาย amino/carboxyl group

14 การทดลองที่ 2 - การตกตะกอนโปรตีน 2.1 การปรับ pH ไปที่ isoelectric point เนื่องจากโปรตีนจะมีประจุสุทธิเป็น 0 ทำให้แรงผลัก (electrostatic) ระหว่างโมเลกุลหมดไป โปรตีนจึงละลายได้น้อยที่สุดและตกตะกอนได้ง่ายที่ pI ที่ pH = pI (isoelectric point) NET CHARGE = 0

15 การทดลองที่ 2 - การตกตะกอนโปรตีน 2.1 การปรับ pH ไปที่ isoelectric point Demonstration ให้สังเกตการตกตะกอนของ casein ที่ pH ต่างๆ

16 การทดลองที่ 2 - การตกตะกอนโปรตีน 2.1 การปรับ pH ไปที่ isoelectric point Demonstration ให้สังเกตการตกตะกอนของ casein ที่ pH ต่างๆ หลอดที่ 1, pH 3.5 หลอดที่ 2, pH 4.1 หลอดที่ 3, pH 4.7 หลอดที่ 4, pH 5.4 หลอดที่ 5, pH 6.0 ผลการทดลอง pI ของ casein คือ ………………… - แสดงว่าสารละลายไม่ขุ่น/ไม่เกิดตะกอน +, ++,+++ แสดงความขุ่นจากน้อยไปมาก x, xx, xxx แสดงปริมาณตะกอนจากน้อยไปมาก

17 การทดลองที่ 2 - การตกตะกอนโปรตีน 2.1 การปรับ pH ไปที่ isoelectric point วิธีการทดสอบ M acetic acid 4.5 mL + โปรตีน casein 0.5 mL ผสมให้เข้ากัน (pH ~ 4.7) ตั้งทิ้งไว้ประมาณ 1 นาที สังเกตผลการทดลอง 1 M NaOH 0.5 mL ผสมให้เข้ากัน (pH ~ 7.5) ตั้งทิ้งไว้ประมาณ 1 นาที สังเกตผลการทดลอง เปรียบเทียบกับการทดลองที่ 2.3 ตอบคำถามท้ายการทดลองข้อ 3 A B

18 การทดลองที่ 2 - การตกตะกอนโปรตีน 2.2 การตกตะกอนด้วยเกลือ ammonium sulfate (salting out) โปรตีนที่มี hydration shells หนา ละลายน้ำได้ดี Adding salts ions ของเกลือจะแย่งจับกับน้ำ ทำให้ hydration shell ของ โปรตีนบางลง โปรตีนมีโอกาสเข้าใกล้กันมากขึ้น และรวมตัวตกตะกอน

19 การทดลองที่ 2 - การตกตะกอนโปรตีน 2.2 การตกตะกอนด้วยเกลือ ammonium sulfate (salting out) ตั้งทิ้งไว้ 1 นาที และสังเกตผลการทดลอง เปรียบเทียบผลการทดลองกับการทดลองที่ 2.3 น้ำละลายไข่ขาว 2 mL + saturated ammonium sulfate 2 mL (100% saturation) เขย่าให้เข้ากัน สังเกตผลการทดลอง Distilled water 4 mL ปิดปากหลอดด้วย parafilm ผสมให้เข้ากัน ตอบคำถามท้ายการทดลองข้อ 1 A B

20 การทดลองที่ 2 - การตกตะกอนโปรตีน 2.3 การตกตะกอนโปรตีนด้วยความร้อน (heat coagulation)

21 การทดลองที่ 2 - การตกตะกอนโปรตีน 2.3 การตกตะกอนโปรตีนด้วยความร้อน (heat coagulation) HYDROPHOBIC INTERACTION Protein folding Hydrophobic side chains ส่วนใหญ่จะรวมกันอยู่ ภายในโมเลกุลของโปรตีน ห่างจากสารละลายที่เป็นน้ำ

22 การทดลองที่ 2 - การตกตะกอนโปรตีน 2.3 การตกตะกอนโปรตีนด้วยความร้อน (heat coagulation) HYDROPHOBIC INTERACTION Protein folding Hydrophilic side chains (polar or charged) ส่วนใหญ่จะอยู่ที่ surface ของโมเลกุลของโปรตีน ELECTROSTATIC INTERACTION HYDROGEN BOND COVALENT BOND

23 การทดลองที่ 2 - การตกตะกอนโปรตีน 2.3 การตกตะกอนโปรตีนด้วยความร้อน (heat coagulation)

24 การทดลองที่ 2 - การตกตะกอนโปรตีน 2.3 การตกตะกอนโปรตีนด้วยความร้อน (heat coagulation) น้ำละลายไข่ขาว 2 mL + Distilled water 2 mL ผสมให้เข้ากัน สังเกตผลการทดลอง เปรียบเทียบกับข้อ 2.1 & 2.2 ตะกอนโปรตีนกลับไปละลายใหม่หรือไม่ 10% acetic acid 5 หยด นำไปแช่ในน้ำเดือด 5 นาที แล้วตั้งทิ้งไว้ให้เย็น สังเกตผลการทดลอง Distilled water 4 mL ปิดปากหลอดด้วย parafilm ผสมให้เข้ากัน ตั้งทิ้งไว้ 1 นาที ตอบคำถามท้ายการทดลองข้อ 2 A B

25 การทดลองที่ 2 - การตกตะกอนโปรตีน 2.4 การตกตะกอนด้วย protein precipitating agents สารบางอย่าง เช่น เกลือของโลหะหนัก (Hg 2+, Pb 2+, Cu 2+ ) หรือ Alkaloidal reagents สามารถทำให้โปรตีนตกตะกอนได้ โดยเข้าจับกับโปรตีนที่มีประจุตรงข้าม ทำให้โปรตีนตกตะกอน Hg 2+ - charged protein + charged protein Hg 2+ - charged protein - charged protein Hg 2+ - charged acid + charged protein + charged protein + charged protein - charged acid - charged acid - charged acid Protein precipitation

26 การทดลองที่ 2 - การตกตะกอนโปรตีน 2.4 การตกตะกอนด้วย protein precipitating agents หยดน้ำละลายไข่ขาว 1 หยดลงบนสไลด์ จำนวน 5 แห่ง หยดน้ำยาต่อไปนี้อย่างละ 1 หยด ลงในน้ำละลายไข่ขาว 1. Saturated mercuric chloride (HgCl 2 ) 2. Saturated picric acid 3. 10% trichloracetic acid 4. 2% tannic acid วิธีการทดสอบ 5. control (ไม่ต้องหยดน้ำยาใดๆ)

27 การทดลองที่ 2 - การตกตะกอนโปรตีน 2.4 การตกตะกอนด้วย protein precipitating agents  สังเกตตะกอน หรือ ความขุ่นโดยดูบนกระดาษสีเข้ม Protein precipitating agents ปริมาณและลักษณะตะกอน Saturated mercuric chloride Saturated picric acid 10% trichloroacetic acid 2% tannic acid +, ++,+++,++++ แสดงความขุ่นจากน้อยไปมาก หรือ ปริมาณตะกอนที่เกิดขึ้น

28


ดาวน์โหลด ppt LAB : PROTEIN CHEMISTRY JUN 27 th, 2014 RUJIRA PATANAWANITKUL, M.D. CHAIYAWAT SUPPASILP, M.D. ASSOCIATE PROFESSOR NEDNAPIS TIRAWANCHAI, Ph.D.

งานนำเสนอที่คล้ายกัน


Ads by Google