งานนำเสนอกำลังจะดาวน์โหลด โปรดรอ

งานนำเสนอกำลังจะดาวน์โหลด โปรดรอ

การเทียบความทึบแสง (Spectrophotometry) และการใช้เครื่อง Spectrophotometer การเทียบความทึบแสง (Spectrophotometry) และการใช้เครื่อง Spectrophotometer DR.

งานนำเสนอที่คล้ายกัน


งานนำเสนอเรื่อง: "การเทียบความทึบแสง (Spectrophotometry) และการใช้เครื่อง Spectrophotometer การเทียบความทึบแสง (Spectrophotometry) และการใช้เครื่อง Spectrophotometer DR."— ใบสำเนางานนำเสนอ:

1 การเทียบความทึบแสง (Spectrophotometry) และการใช้เครื่อง Spectrophotometer การเทียบความทึบแสง (Spectrophotometry) และการใช้เครื่อง Spectrophotometer DR. CHATCHAWAN SRISAWAT

2 BIOCHEMICAL ANALYSIS • Qualitative (คุณภาพวิเคราะห์) e.g. to identify the components of a substance or mixture. Barfoed’s test (test for monosaccharides) Commassie blue test (test for proteins) xylose glucose fructose lactose sucrose (disaccharide) (monosaccharide) Negative Positive

3 • Quantitative (ปริมาณวิเคราะห์) to determine the amounts or proportions of the components of a substance. ระดับน้ำตาลในพลาสมา = 105 mg/dl Gravimetry (การชั่ง) Gravimetry (การชั่ง) Accurate BIOCHEMICAL ANALYSIS but may not be practical! ระดับโปรตีนในซีรั่ม = 7.2 g/dl e.g.

4 การเทียบความทึบแสง (Spectrophotometry) เป็นวิธีที่นิยมใช้ใน quantitative analysis การวิเคราะห์หาค่าความเข้มข้นของสารโดยอาศัยความสามารถในการดูดกลืนแสงของสารที่ความ ยาวคลื่นหนีงๆ

5 การเทียบความทึบแสง (Spectrophotometry) สำหรับสารหนึ่งๆ จะมีการดูดกลืนแสงได้ดี ที่ความยาวคลื่นหนึ่งๆ เรียกว่า  max หลักการ

6 hh IoIo I ความทึบแสง (absorbance หรือ optical density [O.D.]) = log I o /I Absorbance เป็น 0 เมื่อไม่มีการดูดกลืนแสง (I = I o ) Absorbance > 0 เมื่อมีการดูดกลืนแสง (I < I o ) I o = light intensity ก่อนผ่านสารละลาย I = light intensity หลังผ่านสารละลาย การเทียบความทึบแสง (Spectrophotometry) หลักการ

7 hh IoIo I Lambert-Beer’s law mg/ml A  c c = ความเข้มข้นของสารละลาย A  l l = ระยะทางที่แสงผ่านสารละลาย l 1l 1 l 2l 2 การเทียบความทึบแสง (Spectrophotometry) หลักการ

8 A =  l c A= absorbance หรือ optical density (O.D.)  = ค่าคงที่ของการดูดกลืนแสง (extinction coefficient) l = ระยะทางที่แสงผ่านสารละลาย c = ความเข้มข้นของสารละลาย ดังนั้น การวัดความทึบแสง สามารถใช้วิเคราะห์หาปริมาณ ของสารที่ต้องการตรวจสอบได้ ดังนั้น การวัดความทึบแสง สามารถใช้วิเคราะห์หาปริมาณ ของสารที่ต้องการตรวจสอบได้  O.D. = constant x concentration เมื่อ ระยะทางที่แสงผ่านคงที่ การเทียบความทึบแสง (Spectrophotometry) หลักการ

9 การเทียบความทึบแสง (Spectrophotometry) ตัวอย่าง การหาความเข้มข้นของสาร A โดยวิธีเทียบความทึบแสง • เตรียมสารละลายมาตรฐาน (standard solution) ของสาร A ที่รู้ความเข้มข้น • สารละลาย unknown ที่ต้องการวิเคราะห์ • เครื่องวัดความทึบแสง (spectrophotometer) e.g. ได้จากการชั่งสาร A และทำเป็นสารละลายที่มีความเข้มข้นที่ต้องการ เช่น 250, 500, 1500 mg/dl

10 การเทียบความทึบแสง (Spectrophotometry) ตัวอย่าง การหาความเข้มข้นของสาร A โดยวิธีเทียบความทึบแสง - วิธีที่ 1 • วัดค่าความทึบแสง (O.D.) ของ standard solutions แล้วนำมา plot standard curve. • วัดค่าความทึบแสง (O.D.) ของ unknown แล้วอ่านค่าความเข้มข้นจาก standard curve. ถ้าอ่านค่า O.D. ของ unknown ได้ 0.45 ความเข้นข้นของสาร A ~ 1000 mg/dl

11 การเทียบความทึบแสง (Spectrophotometry) ตัวอย่าง การหาความเข้มข้นของสาร A โดยวิธีเทียบความทึบแสง - วิธีที่ 2 เนื่องจากความสัมพันธ์ระหว่าง O.D. และ ความเข้มข้น เป็นเส้นตรง O.D. = constant x concentration อาจวัดความทึบแสงโดยใช้ standard solution เพียง ค่าเดียว แล้วคำนวณหาค่าความเข้มข้นของ unknown ดังนี้ Ds = constant x Cs Du = constant x Cu Ds, Du = O.D. ของน้ำยามาตรฐานและ unknown Cs, Cu = concentration ของน้ำยามาตรฐานและ unknown 1 2 Cu = Du x Cs Ds

12 การเทียบความทึบแสง (Spectrophotometry) เนื่องจากความสัมพันธ์ระหว่าง O.D. และ ความเข้มข้น เป็นเส้นตรง O.D. = constant x concentration อาจวัดความทึบแสงโดยใช้ standard solution เพียง ค่าเดียว แล้วคำนวณหาค่าความเข้มข้นของ unknown ดังนี้ e.g. Ds ของ standard solution 1500 mg/dl = 0.68 Du ของ unknown = 0.45 Cu = Du x Cs Ds Cu = 0.45 x 1500 mg/dl 0.68 Cu = 992 mg/dl ตัวอย่าง การหาความเข้มข้นของสาร A โดยวิธีเทียบความทึบแสง - วิธีที่ 2

13 การเทียบความทึบแสง (Spectrophotometry) ในกรณีที่สารที่ต้องการวิเคราะห์ไม่มีสี (นั่นคือ ไม่ดูดกลืนแสงในช่วง visible spectrum ซึ่ง ใช้ในการเทียบการทึบแสง) ???? protein (ไม่มีสี) + biuret product สีม่วง  max = 550 nm ใช้ปฏิกิริยาที่จำเพาะกับสารที่ต้องการวัด และให้ product ที่มีสี ซึ่งจะมีปริมาณแปรผันตามปริมาณ สารที่ต้องการวิเคราะห์และสามารถวัดได้โดยวิธี spectrophotometry g/dl

14 การเทียบความทึบแสง (Spectrophotometry) ในกรณีที่สารที่ต้องการวิเคราะห์ไม่มีสี (นั่นคือ ไม่ดูดกลืนแสงในช่วง visible spectrum ซึ่ง ใช้ในการเทียบการทึบแสง) ???? glucose (ไม่มีสี) + glucose oxidase & chromogenic substrate product สีแดง  max = 505 nm ใช้ปฏิกิริยาที่จำเพาะกับสารที่ต้องการวัด และให้ product ที่มีสี ซึ่งจะมีปริมาณแปรผันตามปริมาณ สารที่ต้องการวิเคราะห์และสามารถวัดได้โดยวิธี spectrophotometry

15 ตัวอย่าง การวิเคราะห์ serum protein (วิธี biuret) หน้า 64 เตรียมหลอดทดลอง และเติมน้ำยาตามลำดับ Standard Unknown น้ำยาโปรตีนมาตรฐาน 7 g/dl (  l) 50 - serum (  l) - 50 น้ำยา biuret (ml) 4 4 ผสมตั้งทิ้งไว้อย่างน้อย 5 นาที แล้วเทียบความทึบแสงที่ 550 nm การเทียบความทึบแสง (Spectrophotometry) Blank น้ำเกลือนอร์มัล (  l)

16 หลอดน้ำยา blank คืออะไร? หลอดที่มีน้ำยาหรือสารทุกอย่างที่ใช้ทำปฎิกิริยา แต่ไม่มีสารที่ต้องการตรวจ hh IoIo I เนื่องจากตัวน้ำยาหรือสารที่ใช้ทำปฎิกิริยา อาจมีการดูดกลืนแสงได้บ้าง ดังนั้นจึงต้องเตรียมน้ำยา blank เพื่อใช้ปรับ ค่า O.D. ให้เป็น 0 ก่อนที่จะใช้วัด O.D. ของ standard หรือ unknown blank น้ำยา biuret น้ำยา biuret + protein unknown hh IoIo I การเทียบความทึบแสง (Spectrophotometry) ตัวอย่าง การวิเคราะห์ serum protein (วิธี biuret) หน้า 64

17 หลอดน้ำยา blank คืออะไร? หลอดที่มีน้ำยาหรือสารทุกอย่างที่ใช้ทำปฎิกิริยา แต่ไม่มีสารที่ต้องการตรวจ การเทียบความทึบแสง (Spectrophotometry) ตัวอย่าง การวิเคราะห์ serum protein (วิธี biuret) หน้า ??? Standard Unknown น้ำยาโปรตีนมาตรฐาน 7 g/dl (  l) 50 - serum (  l) - 50 น้ำยา biuret (ml) 4 4 Blank น้ำเกลือนอร์มัล (  l)

18 Spectronic 20 - analog reading การใช้เครื่อง spectrophotometer

19 วิธีการใช้เครื่องจะมีบอกไว้ที่ตัวเครื่อง ให้นักศึกษาทำไปตามขั้นตอนดังกล่าว

20 1. Turn on - warm up 15 min การใช้เครื่อง spectrophotometer ทางห้อง lab จะทำการเปิดเครื่องและ warm up ให้ก่อนการใช้งาน

21 2. Set zero % transmittance การใช้เครื่อง spectrophotometer hh IoIo I Transmittance = I IoIo Absorbance (O.D.) = log (Io/I)

22 3. Set wavelength Wavelength adjustment knob การใช้เครื่อง spectrophotometer ปกตินักศึกษาไม่ต้องปรับ wavelength เอง ทางห้อง lab จะปรับให้ แต่ควรตรวจสอบให้แน่ใจว่า เครื่องที่ ใช้วัด ได้ตั้งค่า wavelength ที่ถูกต้อง

23 4. Insert blank การใช้เครื่อง spectrophotometer ถ่ายน้ำยา blank ลงใน cuvette แล้ว ใส่ลงใน cuvette holder

24 cuvette การใช้เครื่อง spectrophotometer Cuvette = หลอดแก้วพิเศษสำหรับใช้ในการเทียบความทึบแสง •ให้นักศึกษาใช้ด้วยความระมัดระวังเนื่องจากมีราคาแพง • สารละลายที่ใช้จะวัดความทึบแสงจะถูกถ่ายลงใน cuvette ก่อนที่จะใส่ลงในเครื่อง spectrophotometer

25 • ก่อนใช้ cuvette ควร rinse cuvette ด้วยน้ำยาที่จะอ่าน 1-2 ครั้ง • ควรมีน้ำยาใน cuvette ~ 1/2 ของหลอด (อย่างน้อยสุด ~ 1/3) hh IoIo I แต่ไม่ควรใช้น้ำยา rinse มาก จนทำให้เหลือน้ำยาไม่พอสำหรับอ่าน O.D. การใช้ cuvette การใช้เครื่อง spectrophotometer

26 • จับ cuvette ให้ถูกวิธี การใช้ cuvette การใช้เครื่อง spectrophotometer • ก่อนที่จะใส่ cuvette ลงในเครื่อง spectrophotometer ให้เช็ดข้างหลอดด้วยกระดาษ ทิชชูให้สะอาดเสมอ

27 • sample holder ของเครื่อง spectronic 20 จะมีขีด (ลูกศรชี้) ที่เป็นเครื่องหมาย เพื่อให้ใส่ cuvette ได้ถูกต้อง โดยเครื่องหมายขีดขาวบนหลอด cuvette ต้องตรงกับขีดบน cuvette holder การใช้ cuvette การใช้เครื่อง spectrophotometer

28 4 -5. Insert blank - set 0 absorbance or 100% transmittance (set full scale) การใช้เครื่อง spectrophotometer hh IoIo I blank น้ำยา biuret น้ำยา biuret + protein unknown hh IoIo I

29 6-7. Insert unknown - Read absorbance การใช้เครื่อง spectrophotometer

30 * การอ่านค่าจากเครื่อง spectronic ที่เป็น analog reading ควรมีความรอบคอบในการอ่าน โดยเฉพาะการอ่านค่าจุดทศนิยมและการแบ่ง scale ซึ่งเป็นขั้นตอนที่มักผิดพลาดได้บ่อย การใช้เครื่อง spectrophotometer

31 Thermo Spectronic - digital reading การใช้เครื่อง spectrophotometer

32 ปุ่มปิด/เปิด ปุ่ม set zero absorbance (set full scale) Wavelength adjustment knob การใช้เครื่อง spectrophotometer

33 ถ้าต้องการอ่าน absorbance ให้กด switch มาที่ตำแหน่ง ดังกล่าว วิธีการใช้เครื่อง การใช้เครื่อง spectrophotometer

34 1. Turn on - warm up 15 min 2. Set wavelength * เครื่อง Thermospectronic ไม่ต้อง set zero transmittance เหมือนเครื่อง Spectronic 20 การใช้เครื่อง spectrophotometer

35 Insert blank and set zero absorbance (set full scale) 5-6. Insert sample and read absorbance การใช้เครื่อง spectrophotometer

36 สรุปสิ่งที่ต้องทำ การวิเคราะห์ serum protein (วิธี biuret) เตรียมหลอดทดลอง และเติมน้ำยาตามลำดับ Standard Unknown น้ำยาโปรตีนมาตรฐาน 7 g/dl (  l) 50 - serum (  l) - 50 น้ำยา biuret (ml) 4 4 • ผสมตั้งทิ้งไว้ 5 นาที แล้วเทียบความทึบแสงที่ 550 nm Blank น้ำเกลือนอร์มัล (  l) • คำนวณความเข้มข้นของโปรตีนในสารละลาย unknown Cu = Du x Cs Ds

37 • ปรึกษาอาจารย์ผู้ดูแลในห้องถึงวิธีใช้ และ สาเหตุที่อาจทำให้ได้ค่าไม่แม่นยำ • อาจจะทำซ้ำได้ถ้าต้องการแก้ไขข้อบกพร่องหรือเพิ่มความชำนาญ • นักศึกษาอาจได้ unknown ซีรั่มที่มีหมายเลขแตกต่างกัน ซึ่งค่าของ unknown คือ No. table หารด้วย 3 เหลือเศษ 1 = unknown หมายเลข 1 = 4.0 (3.4 – 4.5) g/dl No. table หารด้วย 3 เหลือเศษ 2 = unknown หมายเลข 2 = 7.7 (7.3 – 8.2) g/dl No. table หารด้วย 3 ลงตัว = unknown หมายเลข 3 = 9.7 (9.4 – 10.0) g/dl


ดาวน์โหลด ppt การเทียบความทึบแสง (Spectrophotometry) และการใช้เครื่อง Spectrophotometer การเทียบความทึบแสง (Spectrophotometry) และการใช้เครื่อง Spectrophotometer DR.

งานนำเสนอที่คล้ายกัน


Ads by Google