1 การผลิตเอทานอลและกรด อินทรีย์ จากลำไยอบแห้ง  นางสาวฐิติพร กัน จันวงศ์  นายณัฐพงษ์ กาละปัน  อ. ดร. นพพล เล็กสวัสดิ์ รหัสโครงการ R50D01001

2 บทนำ  ลำไยเป็นหนึ่งในผลไม้เศรษฐกิจที่ สำคัญของประเทศไทย มีพื้นที่ เพาะปลูกปัจจุบัน 636,000 ไร่  2 ใน 3 ของแหล่งปลูกอยู่ใน จังหวัดเชียงใหม่และลำพูน  ผลผลิตลำไยส่งออก  ลำไยอบแห้ง  ลำไยสด  ลำไยกระป๋องและลำไยแช่แข็ง

3 บทนำ มูลค่าการส่งออกผักและผลไม้ปี พ. ศ ( สำนักงานเศรษฐกิจการเกษตร, 2550)

4 บทนำ

5 วัตถุประสงค์  เพื่อศึกษาการเจริญของกล้า เชื้อจุลินทรีย์ 15 สายพันธุ์ ในอาหาร เลี้ยงปริมาตร 10 ml ที่มีแต่กลูโคสเป็น แหล่งอาหารคาร์บอน โดยใช้เวลา เพาะเลี้ยง 24 ชั่วโมง ณ 25.6 O C  เพื่อศึกษาการเจริญของเชื้อจุลินทรีย์ 15 สายพันธุ์ ในอาหารเลี้ยงปริมาตร 100 ml ที่มีแต่กลูโคสเป็นแหล่งอาหาร คาร์บอน โดยใช้เวลาเพาะเลี้ยง 48 ชั่วโมง ณ 25.6 O C  เพื่อนำเซลล์ที่ได้ไปใช้ในกระบวนการไบ โอทรานส์ฟอร์เมชั่นสำหรับศึกษาอัตรา การผลิต R-phenylacetylcarbinol เริ่มต้นจากไพรูเวตและเบนซาลดีไฮด์ใน ระบบ nonconventional media

6 วิธีการทดลอง

7 การใช้ aseptic technique ในการเติม glycerol stock ของเชื้อจุลินทรีย์ลงในอาหารเลี้ยงเชื้อ แต่ละขวด

8 การเทไนโตรเจนเหลวออกจากถัง

9 วิธีการทดลอง

10 ใช้ aseptic technique เติม 10 ml inoculum ลงในขวดเลี้ยงเชื้อที่มี แหล่งอาหารคาร์บอน

11 วิธีการเก็บตัวอย่าง การ ทดลองที่ 2 ( อาหารเลี้ยงเชื้อ 100 ml + inoculum 10 ml) 0 hr, ชั่ง น้ำหนัก ตอนไม่มี ฝา 48 hr แช่ แข็ง N 2 เหลว ตัวอย่า ง A ตัวอย่า ง B ปริมาณที่ เหลือ ใส่ถุงเย็น, แช่ แข็ง N 2 เหลว ใส่ถุงเย็นชั้นที่สอง, ตัวอย่าง C เก็บรักษาที่ -20 o C

12 วิธีการเก็บตัวอย่าง การ ทดลองที่ 2 ตัวอย่าง A ตัวอย่าง B ละลายที่อุณหภูมิห้อง เก็บไว้ ณ 4 o C หมุนเหวี่ยง 10 นาที ณ 2,822 g ตะกอน เซลล์ ของเหล ว ล้างตะกอนเซลล์ ด้วยน้ำ กลั่น 1 ครั้ง หมุนเหวี่ยง 10 นาที ณ 2,822 g ตัวอย่าง A ตัวอย่าง B วิเคราะห์มวล ชีวภาพแห้ง วิเคราะห์ pH, TSS, HPLC ปรับปริมาตรสุดท้ายเป็น 10 ml ด้วยน้ำกลั่น 0.1 ml หมุนเหวี่ยง 10 นาที ณ 2,822 g วิเคราะห์ PDC, ความ เข้มข้นโปรตีนที่ละลาย น้ำได้ทั้งหมด วิเคราะ ห์ OD60 0

13 การเก็บตัวอย่างที่ผ่านการแช่ ไนโตรเจนเหลว ในของผสมระหว่างน้ำและน้ำแข็ง

14 นำจุลินทรีย์ 4 สายพันธุ์ S. cerevisiae 5606 และ 5020, Z. mobilis 550 และ C. utilis 5198 จากการทดลองที่ 2 มาละลายน้ำ ที่อุณหภูมิห้อง วัดปริมาตรด้วยกระบอกตวง และบันทึกผล หมุนเหวี่ยงที่ 5000 rpm, 10 นาที แยกเซลล์ จากส่วนของเหลวใส เติมน้ำกลั่น 10 ml ลงในหลอดหมุนเหวี่ยงแล้ว vortex เพื่อล้างเซลล์ หมุนเหวี่ยงที่ 5000 rpm, 10 นาที รวมตะกอนเซลล์ ( แยกแต่ละสายพันธุ์ ) ในขวด แก้วใสขนาด 35 ml บันทึกมวลและปริมาตรเซลล์เปียกที่เก็บได้ เก็บมวลชีวภาพในตู้แช่เยือกแข็ง ณ -20 O C

15 จุลินทรีย์ 4 สายพันธุ์ S. cerevisiae 5606 และ 5020, C. utilis 5198 และ Z. mobilis 550

16 ขั้นตอนการเตรียมตัวทำละลายเฟส เดียว ชั่งโซเดียมไพรูเวต g ลงในแต่ละขวด เติมสารละลายเข้มข้น TPP & MgSO 4. 7H 2 O 50  l เบนซาลดีไฮด์ g Set 1 น้ำ 10 ml Set 2 Octanol 5 ml & DPG 5 ml Set 3 Octanol 10 ml Set 4 DPG 10 ml ผสมให้เข้ากัน เก็บไว้ที่ 4 o C

17 ตัวทำละลายเฟสเดียวจำนวน 32 ขวด

18 เติมมวลชีวภาพความเข้มข้นเฉลี่ย 27.2 g มวลแห้ง l -1, 200  l ลงไปในขวดไบโอทรานส์ฟอร์เมชั่น แกว่งขวดในแนวนอนให้ฝาขวดตั้งขึ้น 10 รอบ นำขวดไปตั้งไว้ในตู้เย็น ณ 4 O C 8 h หยุดการทดลองด้วย 100%(w/v) TCA ปริมาตร 1 ml เก็บรักษาไว้ตู้แช่เยือกแข็งอุณหภูมิ -20 O C เริ่มการทดลอง : 21 กุมภาพันธ์ 2551 เวลา น. ยุติการทดลอง : เวลา น. ขั้นตอนการเติมเซลล์ลงในตัวทำ ละลายเฟสเดียว

19 ภายหลังการทดลองเป็นเวลา 8 h ณ 4 O C

20 การหยุดปฏิกิริยาด้วย 1 ml 100%(w/v) TCA

21 ผลการทดลอง การทดลองที่ 2

22

23 โครมาโตแกรมของ S. cerevisiae TISTR 5606 ที่เวลา 0 h ซ้ำที่ 1 Glucos e

24 โครมาโตแกรมของ S. cerevisiae TISTR 5606 ที่เวลา 48 h ซ้ำที่ 1 Glucos e Etha nol

25

26

27

28

29

30

31 วิจารณ์และสรุปผลการ ทดลอง  S. cerevisiae TISTR 5020, 5606 และ Z. mobilis TISTR 405, 550 เป็น ethanol producer ที่ดี  ใช้ glucose ในการผลิต ethanol  pH ลดลงเล็กน้อย  ความสัมพันธ์ระหว่าง dry biomass และ OD600

32 การทดลองที่จะทำต่อไป  วิเคราะห์ความเข้มข้นโปรตีนโดยใช้ วิธีการของ Bradford ของจุลินทรีย์ 15 สายพันธุ์ที่เวลา 0 ชั่วโมง ซ้ำที่ 1 และ 2 เพื่อใช้ในการเปรียบเทียบกับ การวิเคราะห์ PDC activity  วิเคราะห์ PDC activity ของ จุลินทรีย์ 15 สายพันธุ์ที่เวลา 48 ชั่วโมงซ้ำที่ 2

33 การทดลองที่จะทำต่อไป ( ต่อ )  วิเคราะห์ปริมาณสารตั้งต้นและสาร ผลิตภัณฑ์ต่าง ๆ ในกระบวนการ ผลิต R-PAC ด้วยวิธี biotransformation  ปริมาณ pyruvate  spectrophotometer  ปริมาณ acetaldehyde  spectrophotometer  ปริมาณ acetoin  HPLC, HPX 87H  ปริมาณ benzoic acid  HPLC, C8  ปริมาณ R-PAC  HPLC, C8

34 Q & A