กรมวิทยาศาสตร์การแพทย์ การตรวจวินิจฉัยทางห้องปฏิบัติการ โรคทางเดินหายใจเฉียบพลันรุนแรง (Severe Acute Respiratory Syndrome : SARS) กรมวิทยาศาสตร์การแพทย์ 14 January 2547

เชื้อไวรัสที่เป็นสาเหตุของการเกิดโรค SARS SARS Coronavirus (SARS CoV) Family Coronaviridae Positive stranded RNA enveloped coronavirus-like particle 60-130 nm diameter Replicate in the cytoplasm of animal host cells Detection of viral RNA High concentration of viral RNA in sputum low level of RNA in plasma at acute phase Shedding of virus in feces at late convalescent phase

เชื้อไวรัสที่เป็นสาเหตุของการเกิดโรค SARS SARS Coronavirus (SARS CoV) SARS CoV genome SARS CoV is neither a mutant of known coronavirus, nor a recombinant form of known coronaviruses Transmission person-to-persons by droplets, hand contamination, small particle aerosols, fomites

คุณสมบัติที่สำคัญของ SARS CoV ในการตรวจทางห้องปฏิบัติการ พลาสมาของผู้ป่วยจะค่อนข้างช้า (~ 21 วัน หลังจากมี อาการ) Nasopharyngeal aspirate : พบไวรัสระยะแรกๆ (3 วัน) ระดับต่ำ (32%) และสูงขึ้นจนถึงวันที่ 14 หลังจากมี อาการ (68%) (Peiris 2003) Feces : ตรวจพบ viral RNA ในอุจจาระได้ค่อนข้างนาน (~ 12 -14 วัน) (97%) Urine : อัตราการตรวจพบ viral RNA ได้ 42%

ข้อบ่งชี้การติดเชื้อ SARS CoV ตรวจพบไวรัส ตรวจพบเชื้อไวรัสจากเซลล์ที่เลี้ยงในขวด ทดลอง (virus isolation) ตรวจพบ RNA ของไวรัส ตรวจพบแอนติเจนของไวรัส ตรวจพบการตอบสนองของภูมิคุ้มกันต่อ SARS CoV ตรวจพบภูมิคุ้มกัน (antibody) ต่อไวรัส

วิธีการตรวจวิเคราะห์ทางห้องปฏิบัติการของ SARS CoV (1) ตรวจหาไวรัส หรือ สารพันธุกรรมของไวรัส การแยกเชื้อไวรัส (Virus isolation) - วิธีการยุ่งยากต้องทำในห้องปฏิบัติการเชื้ออันตรายระดับ 3 - ความไวในการตรวจพบต่ำ การตรวจหาโปรตีนของไวรัส - ยังไม่มีวิธีการตรวจ การตรวจหา RNA ของไวรัส - Nested RT PCR, Real-time RT-PCR - มีความจำเพาะและความไวสูงกว่าวิธีอื่น

การเก็บตัวอย่างจากผู้ป่วยเพื่อส่งตรวจ 1 เพื่อการแยกเชื้อไวรัสและตรวจหา viral RNA - Nasopharyngeal swab (NPS) หรือ Throat swab (TS) - Bronchoalveolar lavage (BAL) หรือ Tracheal aspirate (TA) (ให้เก็บวันที่ 3-5 และ วันที่ 9-12 หลังจากมีอาการ) 2. เพื่อตรวจหาแอนติบอดีและเชื้อชนิดอื่นๆ - EDTA blood และ clot blood (ให้เก็บวันที่ 3-5 และ วันที่ 21-28 หลังจากมีอาการ)

วิธีการตรวจวิเคราะห์ทางห้องปฏิบัติการของ SARS CoV (2) ตรวจหาระดับภูมิคุ้มกัน - วิธีที่ใช้ตรวจ ELIZA หรือ Immunofluorescence assay (IFA) - เป็นการตรวจหาแอนติบอดีในพลาสมาหรือซีรัมผู้ ป่วยที่ระยะ acute (3-5 วัน) และ convalescent phase (21-28 วัน) - ส่วนใหญ่จะตรวจพบแอนบอดีได้ในระยะเวลาหลัง มีอาการมากกว่า 10 วันขึ้นไป

การวินิจฉัยผลทางห้องปฏิบัติการ (1) การแปลผล (ผลบวก) ผลการแยกเชื้อไวรัสเป็นบวกและยืนยันผลโดยวิธี RT-PCR - มีเชื้อไวรัส SARS CoV ในตัวอย่างส่งตรวจ ผลการตรวจพบ SARS-CoV RNA ในสารคัดหลั่งเป็นบวก At least in two specimens (eg nasopharyngeal and stool) OR The same specimen collected on two or more occasions during the course of the illness OR Two different assays or repeat PCR using a new RNA extract from the original clinical sample on each occasion of testing (อาจจะไม่ได้หมายความว่ามีเชื้อไวรัสที่มีชีวิตที่จะสามารถแพร่เชื้อได้) ผลการตรวจพบแอนติบอดีต่อ SARS CoV ในพลาสมาหรือซีรัม - มีการติดเชื้อ SARS CoV มาก่อน (previous infection) - หากมีการตรวจพบว่าระดับแอนติบอดีสูงขึ้นระหว่าง acute และ convalescent phase ต่างกัน 4 เท่า หรือ จากผลลบเป็นผลบวก หมายถึงมีการติดเชื้อใน ปัจจุบัน (recent infection)

การวินิจฉัยผลทางห้องปฏิบัติการ (2) การแปลผล (ผลลบ) ผลการตรวจโดยการแยกเชื้อ หรือ SARS CoV RNA เป็นลบ อาจจะมีสาเหตุจากเชื้อชนิดอื่น อาจจะตรวจไม่พบเนื่องจากวิธีการตรวจมีคุณภาพไม่ดีพอ เนื่อง จากขณะนี้ยังไม่วิธีใดที่ผ่านการประเมินคุณภาพ อาจจะตรวจไม่พบเนื่องจากการเก็บตัวอย่างไม่พอดีกับเวลาที่มี ระดับไวรัสสูงในร่างกายสูงพอที่จะตรวจพบได้

การวินิจฉัยผลทางห้องปฏิบัติการ (3) การแปลผล (ผลลบ) ผลการตรวจแอนติบอดีเป็นลบ หากให้ผลลบในตัวอย่างเลือดที่เก็บหลังวันที่ 21 หลังจาก มีอาการ หมายความว่าไม่มีการติดเชื้อ SARS CoV หากให้ผลลบในตัวอย่างเลือดที่เก็บก่อนวันที่ 21 หลังจาก มีอาการ ให้เก็บตัวอย่างเลือดวันที่ 21 หรือมากกว่าส่ง ตรวจ

Stability of SARS CoV The virus is stable in feces and urine at room temperature for 1-2 days. In supernatants of infected cell culture, the virus concentration reduce only one log in RT with in 48 hours. The virus can be heat inactivated at 56oC and loses infectivity after exposure to common disinfectants.

Biosafety consideration For routine diagnostic testing of serum and blood samples, PCR, examination of mycotic and bacterial cultures, BSL-2 facilities with appropriate BSL-2 work practices are deemed sufficient. Any procedure that may generate aerosols should be performed in a biological safety cabinet (BSC), and laboratory workers should wear eye protection and a surgical mask in addition to standard protective equipment such as gloves, etc. In vitro cell culture of the etiologic agent and manipulations involving growth or concentration of the etiologic agent require BSL-3 facilities and BSL-3 work practices.