Protein Isolation and Amino acid sequencing
Determination of Primary Structure 1. หาปริมาณโปรตีนจากตัวอย่าง 2. แยกและทำโปรตีนให้บริสุทธิ์ 3. ตรวจสอบกรดอะมิโนที่เป็นองค์ประกอบทั้งหมดและน้ำหนักโมเลกุล 4. S-S--->-SH 5. ตรวจชนิดกรดอะมิโนที่ปลาย N- และ C-
Determination of Primary Structure 6. ย่อยโปรตีนเป็นส่วน ๆ แยกแต่ละส่วนออกจากกัน 7. หาลำดับกรดอะมิโนในแต่ละส่วน ดูส่วนที่ overlap เพื่อการเรียงลำดับ
Amino acid sequencing
การหาปริมาณโปรตีน 1. วัด Absorbancy ที่ 280 nm 2. Biuret reaction (580 nm) 3. Lowry’s method (700 nm) 4. Coomassie brilliant blue
การแยกโปรตีน 1. คุณสมบัติทางประจุ: electrophoresis, ion exchange chromatography 2. คุณสมบัติในการละลาย : pI, neutral salt, organic solvent, complex anions, heavy metal cations 3. คุณสมบัติขนาดของโมเลกุล : gel filtration, SDS-PAGE, ultrafiltration, ultracentrifugation 4. คุณสมบัติเฉพาะตัว: affinity chromatography
Amino acid sequencing 1. หาน้ำหนักโมเลกุล : Gel filtration, SDS-PAGE -2,4-dinitofluorobenzene (DNF), pH 8 -Dansyl chloride, pH 10 -Edman degradation
ตรวจกรดอะมิโนที่ปลาย N- (dansyl chloride)
Amino acid sequencing 3. ตรวจสอบชนิดกรดอะมิโนที่ปลาย C- -carboxypeptidase -enzymes
ตรวจกรดอะมิโนที่ปลาย C-
Amino acid sequencing Amino acid analyzer 4. วิเคราะห์หาส่วนประกอบทั้งหมดของโปรตีน โปรตีน + 6N HCl----> hydrolysis Amino acid analyzer หลักการของ ion-exchange chromatography (fig 4.8)
Edman degradation
Amino acid sequencing
การหาลำดับกรดอะมิโนจากลำดับ DNA