ดาวน์โหลดงานนำเสนอ
งานนำเสนอกำลังจะดาวน์โหลด โปรดรอ
1
ชนิดของกล้องจุลทรรศน์
กล้องจุลทรรศน์ชนิดที่ใช้แสง Bright-field microscope Dark-field microscope Phase-contrast microscope Fluorescence microscopes
2
กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง
กำลังขยายโดยทั่วไป 1000 – 2000 เท่า ภาพที่ได้จะเป็นภาพที่ทึบ พื้นหลังสว่าง ประกอบด้วยเลนส์ใกล้วัตถุหลายอัน parfocal microscopes remain in focus when objectives are changed กำลังขยายของภาพ = กำลังขยายของเลนส์ใกล้ตา x กำลังขยายของเลนส์ใกล้วัตถุ
3
รายละเอียดของภาพ (Resolution power)
ความสามารถในการแยกจุด 2 จุดออกจากกัน ความยาวคลื่นแสง shorter wavelength greater resolution
4
กล้องจุลทรรศน์ Eyepiece Binocular tube Revolving nosepiece Arm
Objective Mechanical stage Fine adjustment Stage Course adjustment Condenser Illuminator Base
5
ความสามารถในการขยายภาพของกล้องจุลทรรศน์
Resolution power ความสามารถของเลนส์ใกล้วัตถุในการแยกจุดสองจุดที่อยู่ใกล้กัน R = 0.6 x /NA Numerical aperture ความสามารถของเลนส์ใกล้วัตถุในการเก็บรวบรวมแสงที่หักเหภายในวัตถุ NA = n sin
6
Working distance Low power High power
7
Working distance Oil Immersion
8
คุณสมบัติของเลนส์ใกล้วัตถุ
Objective lens Property Oil Immersion High power Low power Scanning 0.18 m 0.35 m 0.9 m 2.3 m Resolution power (WL= 450 nm; blue light) mm 4 mm 16 mm 40 mm Focal length 0.1 mm mm 4-8 mm 17-20 mm Working distance 0.25 0.1 Numerical aperture 90-100x 40-45x 10x 4x magnification working distance - ระยะระหว่างเลนส์ใกล้วัตถุ กับผิวของแผ่น กระจกปิดตัวอย่าง หรือ ตัวอย่าง
9
Mechanical Lengths
10
Objective Specifications
11
The 3 Classes of Objectives
Chromatic and Mono-Chromatic Corrections
12
Plan Objectives
13
กล้องพื้นหลังมืด (Dark-Field Microscope)
ภาพที่เกิดจะสว่างกว่าพื้นหลัง ใช้ในการศึกษาตัวอย่างที่มีชีวิต และไม่ต้องการย้อมสี ns
14
Dark field microscope
15
Phase-contrast microscope
ภาพที่เกิดจะแสดงให้เห็นความแตกต่าง โครงสร้างภายในที่เกิดจากการหักเหของแสงที่แตกต่าง ใช้ในการศึกษาเซลล์ที่มีชีวิต โปร่งใสและไม่ต้องย้อมสี เพิ่ม annual diaphragm ใต้ condenser และ phase plate ใน objective lens wave length ~ 1/4 ของปกติ
16
Phase contrast microscope
17
Figure 2.10
18
Fluorescence Microscope
ใช้แสง ultraviolet, violet หรือ blue light ตัวอย่างถูกย้อมด้วย สี fluorochromes ภาพที่เกิด ตัวอย่างหรือ ส่วนที่ถูกย้อมด้วยสีจะเรืองแสง และพื้นหลังจะมืด
19
Fluorescence Microscope
20
ภาพที่เกิดจากกล้อง Fluorescence Microscope
21
การเตรียมตัวอย่างและการย้อมสี
เพิ่มความสามารถในการมองเห็นตัวอย่างให้ชัดเจนขึ้น ช่วยให้เห็นรูปร่างลักษณะของตัวอย่างได้ชัดเจนขึ้น เก็บรักษาตัวอย่าง
22
Fixation หยุดกิจกรรมต่างๆ ภายในเซลล์
เป็นขั้นตอนที่รักษาโครงสร้างทั้งภายนอกและภายในตัวอย่างให้อยู่ในสภาพคงที่ เป็นการทำให้ตัวอย่างติดแน่นอยูบนแผ่นกระจกสไลด์ โดยการใช้ความร้อน เป็นการรักษารูปร่างให้คงที่แต่ไม่รักษาโครงสร้างภายใน โดยการใช้สารเคมี เป็นการรักษาโครงสร้างภายใน รูปร่าง เช่น Formaldehyde, Odmium tetroxide (Os4) , potassium permanganate, Glutaraldehyde
23
การทำให้แห้ง และย้อมสีแบบง่าย (dehydration and simple staining)
ทำให้สามารถมองเห็นโครงสร้างภายในและภายนอกได้ชัดเจนยิ่งขึ้น และแตกต่างจากพื้นหลัง การย้อมสีแบบง่าย ใช้สีเพียงสีเดียว เช่น สีเบสิค (basic dyes)
24
Electron Microscopy ใช้ลำแสงอิเล็คตรอนในการสร้างภาพ
ความยาวคลื่นแสงสั้นกว่าแสงทำให้ภาพที่เกิดขึ้นมีรายละเอียดสูงขึ้น
25
Transmission Electron Microscope
electrons scatter when they pass through thin sections of a specimen transmitted electrons (those that do not scatter) are used to produce image denser regions in specimen, scatter more electrons and appear darker
26
EM
28
Ebola
29
The Scanning Electron Microscope
uses electrons reflected from the surface of a specimen to create image produces a 3-dimensional image of specimen’s surface features
31
Fly head
33
Confocal microscopy have extremely high resolution
can be used to observe individual atoms
34
Confocal Microscopy confocal scanning laser microscope
laser beam used to illuminate spots on specimen computer compiles images created from each point to generate a 3-dimensional image
36
Figure 2.30
37
Biochemical Techniques Assembly of macromolecule
วัตถุประสงค์ เพื่อศึกษาคุณสมบัติและหน้าที่ของส่วนประกอบต่างๆ ของเซลล์ Molecule Small Assembly of macromolecule Large
38
หลักการ คือ การทำให้เซลล์แตกเป็นชิ้นส่วน (Cell fractination) และเก็บชิ้นส่วนของเซลล์มาศึกษา โดย 1. การทำให้เป็นเนื้อเดียวกัน (Homogenization) สามารถทำได้หลายวิธีคือ 1. โดยการบด (Pestle /Moltar) 2. การใช้คลื่นเสียง (Ultrasonic vibration) 3. การสับเป็นชิ้นๆ (Wareing bleden/ Potter homogenizers) 4. การทำให้แข็งตัวและละลาย (Freeze and Thaw) 5. การอัดด้วยความดันสูง (Deactivation) 6. การใช้สารเคมี (Chemical) 7. การใช้เอนไซม์ (Enzyme)
39
Homogenizer
40
Ultrasonic vibration
41
Deep freezer
42
Gel Filtration
43
2. การแยกส่วนประกอบต่างๆ ออกจากกัน
(Separation of the homogenate) 1. การปั่นตกตะกอน (Centrifugation) - Gravity (g) - Relative centrifugal force (RFC) - Rate of sedimentation of components (size, shape, density of particle and solvent, speed) - Differential centrifugation - Rate-zonal or density-gradient centrifugation
44
Differential Centrifigation
45
Differential Centrifigation
46
3. การแยกชิ้นส่วนของเซลล์ (Separation of biomolecules)
1. ความสามารถในการละลาย (Solubility) 2. ขนาด (size) - Centrifugation - Dialysis - Ultrafiltration - Gel filtration - SDS -PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis)
48
Ultrafiltration
49
3. ประจุไฟฟ้า (Charge) Ion exchange chromatography Isoelectric focusing Electrophoresis 4. Biological properties Affinity of chromatography Immunoelectrophoresis Blotting - Southern blot (DNA) - Northern blot (RNA) - Western blot (Protein) Chromatography อื่นๆ (paper. Gas , Thin-layer) PCR (Polymerase chain reaction)
50
Ion Exchange
51
Immunoelectrophoresis
52
Southern blot เป็นเทคนิคที่ศึกษา DNA ที่ได้ทำการแยกด้วย agarose gel electrophoresis
53
Northern blot เป็นเทคนิคที่ศึกษา RNA
54
Western blot
56
PCR (Polymerase Chain Reaction)
เป็นการเพิ่มปริมาณ DNA ที่ต้องการศึกษา โดยการใช้เครื่องเพิ่มปริมาณ DNA ประกอบด้วยขั้นตอน 1. Denaturation เป็นการแยกสาย DNA จากสายคู่ให้เป็นสายเดี่ยว โดยใช้ความร้อน ประมาณ 90-95oC 2. Annealing เป็นการลดอุณหภูมิลงเพื่อให้ Primer มาจับกับสาย DNA ต้นแบบ โดยใช้ความร้อน ประมาณ 50-55oC 3. Extension (primer extension, synthesis) โดยใช้ความร้อน ประมาณ 70-75oC
57
Buffer Optimalization
10 mM Tris HCl, pH 8.3 50 mM KCl mM MgCl2 mM dNTP DNA template concentration Optional compounds
58
Primer Considerations
Primer lengths GC contents Melting temperature Tm = 2(T+A)+4(G+C) Tm difference 3’ and 5’ end considerations
59
PCR Principle
งานนำเสนอที่คล้ายกัน
