Replication 25/11/00 Molecular Genetics 1. Reviews of DNA, RNA, Proteins, and Gene manipulation 2. Replication and Recombination 3. Transcription and Regulation 4. Translation and Regulation 5. Gene mutation and Repair 6. Developmental Genetics Replication.ppt.v.1

Central Dogma of Molecular Genetics

Central Dogma of Molecular Genetics Transfer of Genetic Information จาก Nucleic acid (DNA) ไปยัง Nucleic acid (RNA) และ จาก Nucleic acid (RNA) ไปยัง Protein (product of gene)

The Flow of Genetic Information

Central Dogma of Molecular Genetics Flow ของ genetic information โดย 3 fundamental processes ของ 1. Replication 2. Transcription 3. Translation

Central Dogma of Molecular Genetics Electron micrograph showing the central dogma of genetic information

Replication

Replication Synthesis ให้ daughter duplex DNA โดย DNA molecules จะเหมือน parental duplex DNA ทุกประการ Replication theory 3 possible modes 1. Semiconservative replication : กึ่งอนุรักษ์ 2. Conservative replication : อนุรักษ์ 3. Dispersive replication : อนุรักษ์และกระจาย

Three possible modes of replication

Mechanism of DNA Replication DNA replication มี 2 processes ใน เวลาเดียวกัน คือ 1. Semi conservative replication 2. Discontinuous replication

1. Semiconservative replication DNA replicate โดยใช้ 2 สายเดิม เป็น สายแม่แบ (Template) enzyme ใส่ nucleotides เป็นcomplementary เข้าจับคู่กับ nucleotides บนสายแม่แบบ ได้สายลูก 2 สาย

Semiconservative replication DNA 2 สายลูก เป็น duplex ซึ่ง ในแต่ละ daughter duplex มี DNA สายใหม่ 1 สาย (แดง) และ DNA สายเก่า 1 สาย (ดำ)

2. Discontinuous replication process ขณะที่ replicate ให้ได้ 2 DNA duplex โดย สายหนึ่ง replicate ได้ สายยาวอย่าง ต่อเนื่อง และ อีกสายหนึ่ง replicate เป็น ช่วงสั้นๆ แล้วมีการต่อเป็นสายต่อเนื่องภายหลัง

Discontinuous replication Template 2 สาย ให้ replication ต่างกัน 1) Template ให้ Continuous replication เรียกว่า Leading strand 2) Template ให้ Discontinuous replication เรียกว่า Lagging strand

Direction of replication 1. การยาวของสาย DNA จาก 5’ 3’ เพราะ enzyme DNA polymerase จะนำ nucleotides ต่อเข้าที่ 3’ end ของ สายที่มีอยู่แล้ว (existing chain หรือ primer) ทำให้ สาย DNA สายใหม่ ยาว จาก 5’ 3’ เสมอ บริเวณที่ DNA แม่แบบ 2 สายแยกออกจากกันจะเป็นรูปซ้อม เรียกว่า Replication folk

2. การเจริญของสายลูก ได้ 2 ทาง โดยดูจาก Replication ที่ออกจาก origin site (ori) 21. Unidirectional replication เจริญออกปลายเดียวปลายหนึ่งอยู่กับที่ เป็น stationary fork และ อีกปลายหนึ่งเจริญเคลื่อนที่ เป็น moving fork 2.2 Bidirectional replication เจริญออกสองปลายทั้ง 2 ปลายเป็น moving forks

Unidirectional replication (b) Bidirectional replication (c)

circular DNA มี ori site เดียว Replication ไม่เริ่มที่ปลายสาย DNA แต่เริ่มที่ ตำแหน่งเริ่มต้นที่เรียกว่า Origin of replication หรือ ori site circular DNA มี ori site เดียว linear DNA มีได้หลาย ori sites และ แต่ละช่วงของ replication คือ 1 หน่วย replication เรียกว่า Replicon

Mechanism และ Factors ใน replication 1. Topoisomerase / DNA gyrase ทำหน้าที่คลายเกลียว double helix DNA ในสภาพ Supercoil molecule ทำให้ลดแรง ตึง (strain) ให้เป็น reduced DNA coiling หรือ relaxed หรือ negatively supercoiled (under) หรือ positively supercoiled (over)

Topoisomerase ทำให้ Relaxed DNA (รูปกลาง) หมุนขวามากเกินไป (รูปซ้าย) หรือ หมุนซ้ายเกินไป (รูปขวา) Topoisomerase ตัด DNA 1 สาย และ สายนี้คลายเกียวออก ทำให้ release stress บนสาย DNA

2. Helicase ทำหน้าที่ แยก 2 parental DNA Strands ณ replication fork enzyme นี้ใช้พลังงาน ATP ในเซลล์จำนวนมาก ATP ----------> ADP + Pi + Energy ATPase helicase work อื่นๆ ได้ การแยก 1 base pair ต้องใช้ 2 ATP

3. Single - Strand - Binding Protein (SSB) Replication 25/11/00 3. Single - Strand - Binding Protein (SSB) SSB ทำหน้าที่จับ และเคลีอบ single - stranded DNA บริเวณ replication fork ที่ถูก Helicase แยก ออก เพื่อป้องกันไม่ให้ DNA จับกันเป็น helix คืน Replication.ppt.v.1

4. Priming of DNA ณ จุด ori site มี nucleotides จำนวนหนึ่ง เรียกว่า Primer ซึ่งเป็น RNA สร้างขึ้น ที่ 3’ ของสายแม่แบบก่อน โดย enzyme Primase nucleotides อื่นจึงเข้าถูกนำมาต่อที่ primer เมื่อ DNA synthesis ผ่านไป primer หลุดออกเหลือไว้แต่ DNA เส้นใหม่

5. DNA polymerase DNA polymerase I, II และ III ทำ หน้าที่ 1) ใส่ nucleotides เข้าที่ 3’ ของ primer หรือ existing chain 2) check complementary bases: เป็น Exonuclease ตัด base ที่ผิดออก และไส่ nucleotides ที่ถูกต้อง เรียกว่า Proofreading 3) repair DNA เมื่อมี damage

Three activities of DNA Polymerase b. Endonuclease c. Exonuclease

6. Okazaki fragment บนสาย Lagging template สร้าง DNA จาก 5’ --> 3’ ปกติ แต่ได้เป็นท่อนสั้นๆ โดยสร้าง Primer ก่อน แล้วสร้างท่อน DNA ซึ่ง เรียกว่า Okazaki fragment แล้ว Okazaki fragment จะถูกเชื่อมกันโดย enzyme DNA Ligase เมื่อ primer สลายไป Ligase จะนำ nucleotides เติมช่องว่างให้เต็ม ได้เป็นสาย DNA ต่อเนื่องปกติ

Priming and gap filling before and after Okazaki fragment

7. Telomerase บน lagging strand เริ่ม replicate ที่ 3’ end (ซึ่งก็คือ telomere ของ chromosome) ด้วย primer เมื่อผ่านไปแล้ว primer สลายออก ทำให้ DNA ที่ปลายนี้ของสายลูกยาวไม่เท่าสายแม่แบบ จึงต้องเติม nucleotide คู่สมใส่ให้ได้สายลูกที่สมบูรณ์โดย enzyme telomerase

Telomerase ทำหน้าที่ใส่ GC - rich Sequence สั้น ๆ เข้าที่ 3’ end ของ DNA strand ใหม่ (ในสิ่งมีชีวิตพวก eukaryote) ไม่เช่นนั้นปลายของ chromosome จะขาด Telomere หรือ สั้นกว่าปกติ ทำให้เป็นโรคทางพันธุกรรม

Diagram สรุป DNA replication

Fidelity of replication ความซื่อตรงของการสังเคราะห์ 1. Complex mechanism มี DNA polymerase ทำหน้าที่เป็น 3’ ---> 5’ Exonuclease ทำการ proofreading โดย remove mismatched nucleotides ออก แล้วนำ nucleotides ที่ถูกต้องใส่เข้าไปแทน 2. Primer เป็น RNA ซึ่งเป็นการ guarantee ว่าการเริ่มต้น DNA replication ไม่มีความผิดพลาด

Modes of replication of circular DNA ใน Prokaryotes :bacteria, mitochondria และ chloroplast 1. Theta model 2. D-loop form ใน bacteriophage 3. Rolling circle model หรือ Sigma mode

Rolling circle Modes of replication of circular DNA D form Theta form

Recombination

Recombination The joining of genes, sets of genes, or parts of genes into new combinations, either biologically or through laboratory manipulation

Mechanism ของ recombination กระบวนการ breakage - and - reunion ทำให้ progeny chromosome ของ organisms มี genes ผสม ที่แตกต่างกันมากกว่าที่พบใน parents หรือได้ Nonparental chromosome ซึ่ง ทำให้ survive ได้ดีกว่าในธรรมชาติ

2. Independent assortment Recombination เป็นหลักการของ 1. Crossing over 2. Independent assortment

Types of Recombination 1. Bimolecular recombination ระหว่างต่างDNA โมเลกุล 1.1 Reciprocal recombination 1.2 Nonreciprocal recombination 1.3 Double crossover

2. Intramolecular recombination ใน DNA โมเลกุลเดียวกัน 2.1 Directional repeat recombination 2.2 Inverted repeat recombination

3. Site-specific recombination ระหว่าง DNA sequence ที่เหมือนกัน หรือ DNA regions เดียวกันของแต่ละ Strand เช่น insertion ของ l phage DNA เข้า host DNA ซึ่งเป็น E. coli

4. Illegitimate recombination ระหว่าง DNA sequences ต่างกัน หรือ เหมือนกันเล็กน้อยแต่ไม่มี site - specific เช่น transposable elements หรือ Transposon ซึ่งคือ genes ที่สามารถเคลื่อนย้ายที่จาก chromosome หนึ่ง ไปยังอีก chromosome หนึ่งได้

5. Homologous recombination หรือ generalized recombination ระหว่าง homologous pieces ของ DNA เป็น common form ของ recombination ที่เกิดขึ้นใน meiosis Mechanism เสนอโดย Robin Holiday, 1964

Model for Homologous Recombination Holiday’s Model หลักใหญ่ 4 essential steps : 1. Pairing ของ 2 homologous DNA duplexes 2. Breaking 2 homologous DNA strands

3. Re-forming phosphodiester bonds เพื่อ join 2 homologous strands หรือ same strand ใน intramolecular recombination 4. Breaking & joining อีก 2 homologous DNA strands ที่เหลือ

Basic mechanism โดยละเอียด 8 steps นับจากภายหลัง pairing ของ homologous DNA duplexes แล้ว 1. Nicking ตัด strands ที่จะทำ recombination 2. Crossover การไขว้ของ necked strands 3. Sealing nicks การต่อกันของ strand เดิมภาย หลังไขว้แล้ว

4. Branch migration เป็นการ slide down ของ duplexes ที่จุด crossover และ เป็น optional 5. Bend โมเลกุลตัวเข้าหากันเป็นงอศอก 6. Rotation หมุน 180o ได้ diamond shape ชั่วคราวที่ center ของครึ่งบนและครึ่งล่าง

step 4 -6 ได้ Chi structure หรือ Half Chiasma 7. Nicking ของ 2 duplex 7.1 Nicking same strands 7.2 Nicking opposite strands 8. Sealing nicks ต่อกันครั้งสุดท้าย

Mechanism of Homologous recombination

Nicks ได้ 2 แบบ 1) Nick ที่ same strandsได้ Heteroduplex DNA ในแต่ละ duplex ---> No true recombination 2) Nick ที่ opposite strands ได้ Recombinant molecules / duplex ---> True recombination ของ 2 hybrid DNA strands ซึ่งจะถูกแยกภาย หลังในการแบ่งเชลล์

Factors ที่เกี่ยวข้อง Step 1 ---> 3 โดย Rec A protein ให้ SS DNA invade DS DNA Step 4 ---> 8 โดย Rec BCD protein มี subunit Rec B, Rec C และ Rec D หรือ รวมเรียกว่า Exonuclease V

ผลของ recombination ทำให้ได้ Hybrid DNA ที่เป็น Heterozygous DNA หรือ Heteroduplex DNA ซึ่งจะถูกแยกออกจากกันในการแบ่งเซลล์

กรณี recombination ผิดพลาด ถ้าเกิด mismatch ของ base pair เช่น CA ---> CG หรือ AC ---> AT repair แล้วหรือไม่ repair ทำให้เกิด Gene conversion ---> เปลี่ยน ratio ของ progeny และ เกิด mutation.