Beneficial Effects of Polyphenols Against Diarrhea caused by E.coli Seminar group 8 Beneficial Effects of Polyphenols Against Diarrhea caused by E.coli อาจารย์ที่ปรึกษา อ.น.สพ.ณัฐพงศ์ อัคริมาจิรโชติ Beneficial Effects of polyphenols againt diarrhea caused by E.coli

ทำไมต้อง polyphenols ? การตายของลูกสุกรเนื่องจากท้องเสีย สร้างความเสียหายให้แก่ฟาร์มเลี้ยงสุกร ส่งผลเสียหายทางเศรษฐกิจ เกษตรกรแก้ไขโดยการใช้ยาปฏิชีวนะเพื่อป้องกัน สารตกค้างในผลิตภัณฑ์ ผลิตสัตว์แบบปลอดสารเคมีโดยใช้ feed additive ที่มาจากธรรมชาติ ใช้สาร polyphenols ทดแทนยาปฏิชีวนะในการเลี้ยงสัตว์เพื่อลดปริมาณเชื้อก่อโรคในลำไส้และไม่มีสารตกค้างที่ทำอันตรายต่อผู้บริโภค

Diarrhea Diarrhea is the condition of having three or more loose or liquid bowel movements per day Osmotic diarrhea Secretory diarrhea Altered permeability (exudative) diarrhea Altered mobility diarrhea อาการท้องเสีย หมายถึง ภาวะที่ร่างกายถ่ายอุจจาระเหลวมากกว่า 3 ครั้งต่อวัน หรือถ่ายมีมูกหรือเลือดปนอย่างน้อย 1 ครั้ง หรือถ่ายเป็นน้ำ มีปริมาณมาก ๆ แบ่งตามพยาธิสภาพของการเกิดอาการท้องเสียแบ่งได้เป็น 1. Osmotic diarrhea  2. Secretory diarrhea 3. Altered permeability (exudative) diarrhea 4. Altered mobility diarrhea ผลกระทบจากอาการท้องเสีย 1. กินได้น้อยลง เพราะเบื่ออาหาร 2. เวลาที่อาหารอยู่ในลำไส้ลดลง ทำให้การดูดซึมลดลง 3. เยื่อบุผนังลำไส้มีการเปลี่ยนแปลงจากการติดเชื้อ เป็นผลให้มีการสร้างสารบางอย่างที่ช่วยให้การดูดซึมอาหารเสียสมดุลไป

Strain of E.coli Enterotoxigenic E.coli (ETEC) enterotoxin Enteropathogenic E.coli (EPEC) BFP A/E lesion Enterohemorrhagic E.coli (EHEC) hemolysin shiga toxin Enteroaggregative E.coli (EAEC) mucus biofilm Enteroinvasive E.coli (EIEC) invasion & lateral spread to adjacent cell Diffusely Adherent E.coli (DAEC) finger-like projections

Polyphenols - antioxidant - anticancer Polyphenols secondary metabolite phenolic compounds โครงสร้างประกอบด้วย hydroxyl group เกาะอยู่กับวงแหวน aromatic - antioxidant - anticancer - antiviral activity - antifungal activity - antibacterial activity - antiinflammation

การจำแนกชนิดของสารประกอบ Polyphenols Flavonoids Stilbenes Diferuloylmethane Tannins Phenolic acids Anthocyanins Hydrolysable tannins Anthoxanthins Flavones Condensed tannins Flavan Isoflavones Flavonols Flavanols Catechins

methylation,sulfation, glucuronidation Absorption Dietary polyphenols glycosylated form stomach glucoside form Flavonoids small intestine SGLT1 Brush border hydrolyze β-glucosidase glucosidase Bioavailability of polyphenols conjugation methylation,sulfation, glucuronidation aglycone liver

Elimination Metabolites of polyphenols large conjugated metabolites small conjugated metabolites biliary route urinary route hydrolyze free aglycones conjugated metabolites bile reabsorb enterohepatic cycling

ผลิตภัณฑ์เกี่ยวกับ polyphenols ที่มีจำหน่าย หรือมีการนำไปใช้ HIDROX ™ : เป็นชื่อการค้าของสาร hydroxytyrosol ซึ่งเป็นสาร polyphenols ตามธรรมชาติ OmniVin 10R : มี polyphenols เป็นองค์ประกอบ 75% โดยสกัดมาจากเมล็ดองุ่น ALSOK DAB7 : เป็น hydrolysable tannin Solaray Grapenol : มี polyphenols เป็นองค์ประกอบ 95% http://www.foodnavigator-usa.com/Markets/Sunsweet-teams-up-with-CreAgri-to-develop-beverages-packed-with-olive-polyphenols-on-new-anti-inflammatory-platform http://carol-bond-health-foods.amazonwebstore.com/Solaray-Grapenol-Grape-Seed-Extract-100/M/B000WHHQVC.htm

Mechanisms of polyphenols against diarrhea caused by E.coli Polyphenols มีฤทธิ์ในการต้านอาการท้องเสียที่เกิดจากเชื้อ E.coli ได้อย่างไร - ยับยั้ง ETEC enterotoxin - ยับยั้ง lipopolysaccharide (LPS) - ยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ ATP synthase - ทำลายเยื่อหุ้มเซลล์แบคทีเรีย - ยับยั้งการจับของ ETEC กับ receptor - ยับยั้งการสังเคราะห์ nucleic acid - ยับยั้งการเกิด biofilm

Antidiarrheal activity from ETEC enterotoxins Enterotoxigenic E.coli (ETEC) produced Enterotoxin 2 type 1. heat-labile (LT) 2. heat-stable(STa and STb) Structure of enterotoxins Debeuil, 2013

Antidiarrheal mechanism of flavonoids Activated cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) Epithelial Na+ channel (EnaC) and Cl- channel are controlled by CFTR Na+ , Cl- , H2O  diarrhea Flavonoids  LT-polyphenols Croxen and Finlay, 2010

กลไกของ polyphenols ในการยับยั้ง lipopolysaccharide (LPS) ของแบคทีเรียแกรมลบ LPS = ENDOTOXINS ประกอบด้วย Lipid A Core polysaccharide O-antigen http://www.microbialcellfactories.com/content/5/1/13/figure/F1?highres=y

ในการกระตุ้นภูมิคุ้มกัน กลไกของระบบภูมิคุ้มกัน ในการกำจัด LPS กระตุ้นการอักเสบในลำไส้ http://micro.digitalproteus.com/pathogenesis1.php Lu et al.,2008

Proinflammatory cytokine กระตุ้นให้เกิดการแสดงออก adhesion molecules ICAM-1 & VCAM-1 Leukocyte มารวมกลุ่มกันมากขึ้นที่ลำไส้ ลำไส้อักเสบมากขึ้น Diarrhea

กลไกของ polyphenols ในการยับยั้ง LPS ลดลำไส้อักเสบ DIARRHEA Yang and Seki, 2012

การยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ ATP synthase ใน E.coli F1 F0 โครงสร้างของเอนไซม์ F1F0 ATP synthase ตำแหน่งของ F1ในไซโตพลาสซึม ที่มีการสร้าง ATP โดยการขนส่งโปรตอนผ่านทางรู F0 และเข้ามาในเซลล์ www.pnas.org

โครงสร้างที่แตกต่างกันของ สาร resveratrol, piceatannol และ quercetin Dadi et al., 2009

การยับยั้งการจับของเชื้อ E.coli กับ receptor - ETEC จับกับ enterocyte ในสำไส้ เล็ก โดยเชื้อใช้ fimbriae จับกับ receptor ที่จำเพาะบน enterocyte - สร้างโคโลนีภายในลำไส้และปล่อย สารพิษที่ทำให้เกิดการท้องเสีย ออกมา Verhelst และคณะ พบว่ามีสาร polyphenols ที่สามารถยับยั้งการจับของ fimbriae กับ receptor บนผิวเซลล์ enterocyte ได้ คือ pentagalloyl glucose (PGG) Omnica 45 และ ALSOK โดย Verhelst และคณะ ได้ทำการทดลองโดยใช้ แบคทีเรีย ETEC สายพันธุ์ CVI-1000 ซึ่งมี fimbriae ชนิด F4 อยู่บนผิวเซลล์ ผลการทดลองพบว่าสาร polyphenols สามารถลดการจับของ F4 fimbriae กับ enterocyte ได้ โดย PGG สามารถลดการจับได้มากที่สุด Nataro and kapper, 1998 http://cmr.asm.org/content/11/1/142/F3.expansion.html

การทำลายเยื่อหุ้มเซลล์แบคทีเรีย Catechin-Cu(II) complex เข้าจับและทำลายเยื่อหุ้มเซลล์แบคทีเรียแกรมลบได้ดี การทำลายเยื่อหุ้มเซลล์แบคทีเรีย Ikigai และคณะ ค้นพบว่า catechin สามารถทำให้เกิดรอยรั่วบนเยื่อหุ้มเซลล์แบคทีเรียได้ catechin ที่ใช้ในการศึกษาคือ (-)-epigallocatechin gallate (EGCG) พบมากในชาเขียว ต่อมา Tamba และคณะ ได้ใช้ giant unilamellar vesicles (GUVs) แทนเยื่อหุ้มเซลล์แบคทีเรีย เพื่อศึกษาถึงกลไกการทำลายเยื่อหุ้มเซลล์แบคทีเรีย GUVs คือ vesicle ที่มีเยื่อหุ้มเป็น lipid bilayer เหมือนกับโครงสร้างของเยื่อหุ้มเซลล์ของสิ่งมีชีวิต นิยมใช้ในการศึกษาเกี่ยวกับเยื่อหุ้มเซลล์ Catechin-Cu(II) complex จะทำลายเยื่อหุ้มเซลล์แบคทีเรีย ผ่านกระบวนการของระบบ recycling redox system ผลของปฏิกิริยา reoxidation จะทำให้เกิดสาร reactive oxygen species (ROS) ขึ้น สาร ROS เหล่านี้ทำให้เยื่อหุ้มเซลล์แบคทีเรียเสียหายได้ โดยการทำให้เกิด lipid peroxidation กับเยื่อหุ้มเซลล์ 1.ขั้นแรกจะเกิดปฏิกิริยา reduction จาก Cu(II) ไปเป็น Cu(I) โดย (-)-epigallocatechin (EGC) 2.จากนั้นจะเกิดปฏิกิริยา reoxidation จาก Cu(I) กลับไปเป็น Cu(II) โดยโมเลกุลออกซิเจน (O2) Catechin เข้าจับกับเยื่อหุ้มเซลล์แบคทีเรียแกรมบวก S.aureus ได้ดีกว่าจับกับแบคทีเรียแกรมลบ E.coli Catechin-Cu(II) complex จับกับเยื่อหุ้มเซลล์แบคทีเรียแกรมบวก S.aureus ได้ไม่ดีเท่า จับกับแบคทีเรียแกรมลบ E.coli Vatansever et al.,2013

กลไกการยับยั้งการสังเคราะห์ nucleic acid การเจริญเติบโตของแบคทีเรียต้องอาศัย nucleic acid ซึ่ง แบ่งออกเป็น 2 ชนิด คือ DNA และ RNA เพื่อใช้ในการถ่ายทอด พันธุกรรม มีการค้นคว้าวิจัยเกี่ยวกับ flavonoids ในการออกฤทธิ์ยับยั้ง แบคทีเรีย และพบว่า flavonoids สามารถยับยั้ง DNA replication ของแบคทีเรีย

การทำงานของเอนไซม์ helicase และ topoisomerase หรือ DNA gyrase ในแบคทีเรีย Supercoiling DNA http://en.citizendium.org/images/thumb/6/68/DNAreplicationFORK.jpg/400px-DNAreplicationFORK.jpg

Flavonoids จะมีผลขัดขวางการทำงานของ topoisomerase ที่บริเวณ ATPase domain http://www.nature.com/nrm/journal/v12/n12/fig_tab/nrm3228_F3.html

การยับยั้งการเกิด biofilm http://woundsinternational.files.wordpress.com/2011/02/schematic-representation-of-polymicrobial-biofilm-formation.jpg

Quorum sensing เป็นการสื่อสารระหว่างเซลล์ของE Quorum sensing เป็นการสื่อสารระหว่างเซลล์ของE.coli ที่ใช้ ในการสร้าง biofilm โดยเริ่มจากการเกิด autoinduction https://www.bio.cmu.edu/courses/03441/TermPapers/99TermPapers/Quorum/autoinduction2.gif

Lsr ATP binding cassette (ABC) transporter ในการขนส่ง AI-2 เข้าสู่เซลล์ AI-2 จะเหนี่ยวนำให้เกิดการ transcription ของ lsrACDBFGE operon โดยยีน 4 ตัวแรก (IsrA, IsrC, IsrD, IsrB) และมีการถอดรหัสเพื่อให้ได้ Lsr transport apparatus ที่ใช้ในการขนส่ง AI-2 เข้าเซลล์ Li, 2007

Side effect of polyphenols 1. ดูดซึมธาตุเหล็กจะลดลง 2. ขัดขวางการดูดซึม folate 3. ยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ deiodinase อาจเสี่ยงต่อการเกิด โรคคอพอก 4. Flavonoids drug interactions 5. ลดประสิทธิภาพการทำงานของเอนไซม์ α-amylase, pepsin, trypsin และ lipase 6. การได้รับ polyphenols ในปริมาณที่มากเกินไป กลายเป็นอนุมูล- อิสระหรือส่งเสริมให้เกิดอนุมูลอิสระ เรียกว่า pro-oxidant

เก็บ rectal fecal sample ไปตรวจ Dietary polyphenols reduce diarrhea in enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) infected post-weaning piglets ลูกสุกร อาหาร หมายเหตุ 40 ตัว 20 ตัว Non-infected Group Omnivin เก็บ rectal fecal sample ไปตรวจ ALSOK Omnicoa อาหาร control Infected group ** สายพันธุ์ E.coli ที่ใช้คือ E.coli O149K91 ** ระยะเวลาการทำการทดลอง 13 วัน โดยวันที่ 1-5 ให้อาหารทั้ง 4 ชนิดและน้ำ วันที่ 6 ให้แค่น้ำ (งดอาหาร) ** ทำการเก็บ rectal fecal sample ไปตรวจ ตั้งแต่วันที่ 6 -13

กราฟแสดงผลการทดลอง แสดงปริมาณเชื้อ ETEC ADG Dry matter จากการยับยั้งอาการท้องเสีย พบว่า ALSOK และ Omnivin ลดการขับ ETEC ลงในช่วงวันที่ 6 ถึงวันที่ 13 เมื่อเปรียบเทียบกับ infected control group ในทางตรงกันข้าม Omnicoa ทำให้มีการขับ ETEC ที่ต่ำ แต่ %DM (dry matter) ของอุจจาระไม่แตกต่างกัน เมื่อเทียบกับ infected control group แต่ที่น่าสังเกตก็คือ %DM ใน non-infected Omnicoa control group มีค่าต่ำกว่า non-infected control group เช่นเดียวกันกับ ADG ทั้งๆที่กินอาหารได้เท่ากัน แสดงว่า Omnicoa มีสารประกอบที่ทำให้เกิดท้องเสียอยู่ Verhelst et al., 2013

Conclusion สาร polyphenols มีความหลากหลายทางลักษณะโครงสร้าง คุณสมบัติแตกต่างกัน การเลือกใช้ วัตถุประสงค์ ผลข้างเคียง ประสิทธิภาพในการให้ผลทางการรักษาของสาร polyphenols บางชนิดยังเป็นผลที่ได้จากห้องปฏิบัติการ ต้องศึกษาวิจัยเพื่อให้ทราบผลชัดเจนต่อไป

Thank you for your attention