ชนิดของกล้องจุลทรรศน์ กล้องจุลทรรศน์ชนิดที่ใช้แสง Bright-field microscope Dark-field microscope Phase-contrast microscope Fluorescence microscopes

กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง กำลังขยายโดยทั่วไป 1000 – 2000 เท่า ภาพที่ได้จะเป็นภาพที่ทึบ พื้นหลังสว่าง ประกอบด้วยเลนส์ใกล้วัตถุหลายอัน parfocal microscopes remain in focus when objectives are changed กำลังขยายของภาพ = กำลังขยายของเลนส์ใกล้ตา x กำลังขยายของเลนส์ใกล้วัตถุ

รายละเอียดของภาพ (Resolution power) ความสามารถในการแยกจุด 2 จุดออกจากกัน ความยาวคลื่นแสง shorter wavelength  greater resolution

กล้องจุลทรรศน์ Eyepiece Binocular tube Revolving nosepiece Arm Objective Mechanical stage Fine adjustment Stage Course adjustment Condenser Illuminator Base

ความสามารถในการขยายภาพของกล้องจุลทรรศน์ Resolution power ความสามารถของเลนส์ใกล้วัตถุในการแยกจุดสองจุดที่อยู่ใกล้กัน R = 0.6 x /NA Numerical aperture ความสามารถของเลนส์ใกล้วัตถุในการเก็บรวบรวมแสงที่หักเหภายในวัตถุ NA = n sin 

Working distance Low power High power

Working distance Oil Immersion

คุณสมบัติของเลนส์ใกล้วัตถุ Objective lens Property Oil Immersion High power Low power Scanning 0.18 m 0.35 m 0.9 m 2.3 m Resolution power (WL= 450 nm; blue light) 1.8-2.0 mm 4 mm 16 mm 40 mm Focal length 0.1 mm 0.5-0.7 mm 4-8 mm 17-20 mm Working distance 1.25-1.4 0.55-0.65 0.25 0.1 Numerical aperture 90-100x 40-45x 10x 4x magnification working distance - ระยะระหว่างเลนส์ใกล้วัตถุ กับผิวของแผ่น กระจกปิดตัวอย่าง หรือ ตัวอย่าง

Mechanical Lengths

Objective Specifications

The 3 Classes of Objectives Chromatic and Mono-Chromatic Corrections

Plan Objectives

กล้องพื้นหลังมืด (Dark-Field Microscope) ภาพที่เกิดจะสว่างกว่าพื้นหลัง ใช้ในการศึกษาตัวอย่างที่มีชีวิต และไม่ต้องการย้อมสี ns

Dark field microscope

Phase-contrast microscope ภาพที่เกิดจะแสดงให้เห็นความแตกต่าง โครงสร้างภายในที่เกิดจากการหักเหของแสงที่แตกต่าง ใช้ในการศึกษาเซลล์ที่มีชีวิต โปร่งใสและไม่ต้องย้อมสี เพิ่ม annual diaphragm ใต้ condenser และ phase plate ใน objective lens wave length ~ 1/4 ของปกติ

Phase contrast microscope

Figure 2.10

Fluorescence Microscope ใช้แสง ultraviolet, violet หรือ blue light ตัวอย่างถูกย้อมด้วย สี fluorochromes ภาพที่เกิด ตัวอย่างหรือ ส่วนที่ถูกย้อมด้วยสีจะเรืองแสง และพื้นหลังจะมืด

Fluorescence Microscope

ภาพที่เกิดจากกล้อง Fluorescence Microscope

การเตรียมตัวอย่างและการย้อมสี เพิ่มความสามารถในการมองเห็นตัวอย่างให้ชัดเจนขึ้น ช่วยให้เห็นรูปร่างลักษณะของตัวอย่างได้ชัดเจนขึ้น เก็บรักษาตัวอย่าง

Fixation หยุดกิจกรรมต่างๆ ภายในเซลล์ เป็นขั้นตอนที่รักษาโครงสร้างทั้งภายนอกและภายในตัวอย่างให้อยู่ในสภาพคงที่ เป็นการทำให้ตัวอย่างติดแน่นอยูบนแผ่นกระจกสไลด์ โดยการใช้ความร้อน เป็นการรักษารูปร่างให้คงที่แต่ไม่รักษาโครงสร้างภายใน โดยการใช้สารเคมี เป็นการรักษาโครงสร้างภายใน รูปร่าง เช่น Formaldehyde, Odmium tetroxide (Os4) , potassium permanganate, Glutaraldehyde

การทำให้แห้ง และย้อมสีแบบง่าย (dehydration and simple staining) ทำให้สามารถมองเห็นโครงสร้างภายในและภายนอกได้ชัดเจนยิ่งขึ้น และแตกต่างจากพื้นหลัง การย้อมสีแบบง่าย ใช้สีเพียงสีเดียว เช่น สีเบสิค (basic dyes)

Electron Microscopy ใช้ลำแสงอิเล็คตรอนในการสร้างภาพ ความยาวคลื่นแสงสั้นกว่าแสงทำให้ภาพที่เกิดขึ้นมีรายละเอียดสูงขึ้น

Transmission Electron Microscope electrons scatter when they pass through thin sections of a specimen transmitted electrons (those that do not scatter) are used to produce image denser regions in specimen, scatter more electrons and appear darker

EM

Ebola

The Scanning Electron Microscope uses electrons reflected from the surface of a specimen to create image produces a 3-dimensional image of specimen’s surface features

Fly head

Confocal microscopy have extremely high resolution can be used to observe individual atoms

Confocal Microscopy confocal scanning laser microscope laser beam used to illuminate spots on specimen computer compiles images created from each point to generate a 3-dimensional image

Figure 2.30

Biochemical Techniques Assembly of macromolecule วัตถุประสงค์ เพื่อศึกษาคุณสมบัติและหน้าที่ของส่วนประกอบต่างๆ ของเซลล์ Molecule Small Assembly of macromolecule Large

หลักการ คือ การทำให้เซลล์แตกเป็นชิ้นส่วน (Cell fractination) และเก็บชิ้นส่วนของเซลล์มาศึกษา โดย 1. การทำให้เป็นเนื้อเดียวกัน (Homogenization) สามารถทำได้หลายวิธีคือ 1. โดยการบด (Pestle /Moltar) 2. การใช้คลื่นเสียง (Ultrasonic vibration) 3. การสับเป็นชิ้นๆ (Wareing bleden/ Potter homogenizers) 4. การทำให้แข็งตัวและละลาย (Freeze and Thaw) 5. การอัดด้วยความดันสูง (Deactivation) 6. การใช้สารเคมี (Chemical) 7. การใช้เอนไซม์ (Enzyme)

Homogenizer http://www.freewebs.com/ltaing/chpt7.3Cellfractionation.gif

Ultrasonic vibration

Deep freezer

Gel Filtration http://fig.cox.miami.edu/~cmallery/150/protein/proteinsb.htm

2. การแยกส่วนประกอบต่างๆ ออกจากกัน (Separation of the homogenate) 1. การปั่นตกตะกอน (Centrifugation) - Gravity (g) - Relative centrifugal force (RFC) - Rate of sedimentation of components (size, shape, density of particle and solvent, speed) - Differential centrifugation - Rate-zonal or density-gradient centrifugation

Differential Centrifigation http://www.freewebs.com/ltaing/chpt7.3Cellfractionation.gif

Differential Centrifigation http://www.freewebs.com/ltaing/chpt7.3Cellfractionation.gif

3. การแยกชิ้นส่วนของเซลล์ (Separation of biomolecules) 1. ความสามารถในการละลาย (Solubility) 2. ขนาด (size) - Centrifugation - Dialysis - Ultrafiltration - Gel filtration - SDS -PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis)

Ultrafiltration

3. ประจุไฟฟ้า (Charge) Ion exchange chromatography Isoelectric focusing Electrophoresis 4. Biological properties Affinity of chromatography Immunoelectrophoresis Blotting - Southern blot (DNA) - Northern blot (RNA) - Western blot (Protein) Chromatography อื่นๆ (paper. Gas , Thin-layer) PCR (Polymerase chain reaction)

Ion Exchange http://fig.cox.miami.edu/~cmallery/150/protein/ion_exchange.jpg

Immunoelectrophoresis http://www.haps.nsw.gov.au/edrsrch/edimages/myeloma2.jpg

Southern blot เป็นเทคนิคที่ศึกษา DNA ที่ได้ทำการแยกด้วย agarose gel electrophoresis

Northern blot เป็นเทคนิคที่ศึกษา RNA

Western blot

PCR (Polymerase Chain Reaction) เป็นการเพิ่มปริมาณ DNA ที่ต้องการศึกษา โดยการใช้เครื่องเพิ่มปริมาณ DNA ประกอบด้วยขั้นตอน 1. Denaturation เป็นการแยกสาย DNA จากสายคู่ให้เป็นสายเดี่ยว โดยใช้ความร้อน ประมาณ 90-95oC 2. Annealing เป็นการลดอุณหภูมิลงเพื่อให้ Primer มาจับกับสาย DNA ต้นแบบ โดยใช้ความร้อน ประมาณ 50-55oC 3. Extension (primer extension, synthesis) โดยใช้ความร้อน ประมาณ 70-75oC

Buffer Optimalization 10 mM Tris HCl, pH 8.3 50 mM KCl 1.5 - 2.5 mM MgCl2 50 - 200 mM dNTP DNA template concentration Optional compounds

Primer Considerations Primer lengths GC contents Melting temperature Tm = 2(T+A)+4(G+C) Tm difference 3’ and 5’ end considerations

PCR Principle