รายงานผลการปฏิบัติงานโครงการ/งานวิจัย ประจำปี ๒๕๕๙ รอบ ๑๒ เดือน ชื่อหน่วยงาน สถาบันวิจัยวิทยาศาสตร์สาธารณสุข ชื่อผลผลิต ถ่ายทอดองค์ความรู้ เทคโนโลยี นวัตกรรม และแจ้งเตือนภัยด้านสุขภาพ ชื่อกิจกรรมหลัก วิจัยและพัฒนา ชื่อโครงการ การพัฒนาการตรวจหาสารพิษ Botulinum toxin ด้วยวิธี Antibody Capture ELISA และ immunochromatography ปีที่เริ่มต้นโครงการ 2557 ปีที่สิ้นสุดโครงการ 2560 งบประมาณที่ได้รับในปี 2559 784,000 บาท

ระยะเวลาที่ทำการวิจัย และ แผนการดำเนินงานตลอดโครงการ : ตุลาคม 2557 – กันยายน 2560 กิจกรรม ปีงบประมาณ (พ.ศ.) 2557 2558 2559 2560 1. ทำการสร้างและผลิตโปรตีน Clostridium toxin โดยการสกัดจากอาหารเลี้ยงเชื้อ หรือโดยวิธีพันธุวิศวกรรมจากเชื้อ Clostridium botulinum เพื่อใช้เป็นอิมมูโนเจน 2. ทำการผลิตและจัดหาโมโนโคลนอลแอนติบอดี หรือโพลีโคลนอลแอนติบอดี ที่จำเพาะต่อtoxin 2.1 ฉีดแอนติเจนกระตุ้นสัตว์ทดลอง 2.2 สร้าง Hybridoma clone ระหว่าง spleen cell ของหนู กับ myeloma cell ด้วยเทคนิค Cell fusion 2.3 ตรวจคัดกรองโมโนโคลนอลแอนติบอดีทีมีความ จำเพาะ โดยเทคนิค limit dilution 2.4 คัดเลือก clone ที่เหมาะสมโดยเทคนิค ELISA , western blot analysis 2.5 ขยายขนาดการผลิต และทำแอนติบอดีให้บริสุทธิ์โดยวิธี Affinity Chromatography 3. หาสภาวะที่เหมาะสมในการพัฒนา IC strip ที่ตำแหน่งต่างๆ กระดาษชนิดต่างๆ ที่เหมาะสม Conjugate pad - Capture lines 4. ประเมินคุณภาพห้องปฏิบัติการ 5. ประเมินคุณภาพภาคสนาม 6. การสรุปและวิเคราะห์ข้อมูล

โครงการการพัฒนาชุดทดสอบตรวจหาสารพิษ Botulinum toxin ด้วยวิธีอิมมูโนโครมาโทกราฟี rMAb specificity Clone no. Test line Conjugate ELISA 1. A –HCT F1-2 SL / F1-2 SP F1-2 TL F1-2 TP 2. B MCS92-32 เพิ่มปริมาณการผลิต 3. B-HCR MCS6-27 4. PAN 4E17.1 T= Bont MAb C Conj CF 6 AE 99 GF 33 Fusion 5 C line A B C 1 mg/ml anti mouse Ig T = 2mg/ml B-HCR T = 2 mg/ml PAN T = 2mg/ml B-HCR Conj = 15 OD B-HCR Conj = 30 OD PAN

A B C sample A B C T = 2mg/ml B-HCR T = 2 mg/ml PAN T = 2mg/ml B-HCR Conj = 15 OD B-HCR Conj = 30 OD PAN B complex Spike in medium LOD = 600 ng LOD = +60 ng Culture medium +++ + A 600 ng 1200 ng 1800 ng B C 60 ng

นำมาตำให้ละเอียด (ปรับ pH) ขั้นตอนการเตรียมตัวอย่าง : เนื้อตัวอย่าง(หน่อไม้,ปูดอง)+น้ำ เนื้อตัวอย่าง(ถั่วเน่า)+ GBS ตัวอย่าง pH เดิม pH ใหม่ น้ำหน่อไม้ 3.0 7.0 ปูดอง 6.1 - ถั่วเน่า น้ำส้ม 3.3 นำมาตำให้ละเอียด (ปรับ pH) ชั่งตัวอย่าง 1 g, spike toxin ปั่น 4000 rpm, 30 min mix 30 min, RT นำตัวอย่าง , spike toxin ปั่น 4000 rpm, 30 min IC Test ส่วนน้ำ dilute 1:10 GBS ELISA

B C sample B C T = 2 mg/ml PAN T = 2mg/ml B-HCR Conj = 15 OD B-HCR Conj = 30 OD PAN น้ำหน่อไม้ spike B complex LOD = 200 ng LOD = +100 ng B C

C ปูดอง ถั่วเน่า น้ำส้ม sample C Spike B complex 150 ng T = 2mg/ml B-HCR Conj = 30 OD PAN ปูดอง ตกตะกอน (30 ul ปูดอง : 30 ul buffer) ถั่วเน่า False positive น้ำส้ม Bg เล็กน้อย

Next Plan : 1. ขั้นตอนการเตรียมตัวอย่าง - ปรับ pH อาหารแต่ละชนิดให้เหมาะสม 2. ขั้นการเตรียมชุดทดสอบ - ปรับ buffer ให้เหมาะกับชนิดอาหาร - ลองพ่น T line เพื่อให้ผลทดสอบชัดเจนขึ้น - หา antibody อื่นๆเพิ่มเติม โดยเฉพาะ antibody ต่อ type A

- Clone 4E17.1 (PAN) ให้ผล positive แรง กับ BoNT/A complex 7/29/2016 - Coat BoNT/A complex 0.125 ng/ul - Conjugate anti mouse 1:3000 Dilution(ug/well) F1-2SL F1-2SP F1-2TL F1-2TP 4E17.1 Positive Blank 1.000 0.084 0.068 0.070 0.067 2.657 Out 0.062 0.500 0.066 0.061 2.409 0.058 0.250 0.060 0.063 0.059 2.198 0.056 0.125 2.155 2.331 2.067 1.481 0.031 1.976 0.863 0.015 0.064 1.864 0.502 0.005 1.812 0.345 0.394 BoNT/A complex substrate Anti mouse rMAb BoNT Result: - Clone 4E17.1 (PAN) ให้ผล positive แรง กับ BoNT/A complex

- Clone 4E17.1 (PAN) ให้ผล weak positive กับ BoNT/B complex 8/25/2016 - Coat BoNT/B complex 0.9 ng/ul - Conjugate anti mouse 1:12000 Dilution(ug/well) F1-2SL F1-2SP F1-2TL F1-2TP 4E17.1 Positive Blank 1.000 0.069 0.083 0.071 0.076 0.289 2.954 0.060 0.500 0.064 0.065 0.327 2.105 0.250 0.061 0.067 0.062 0.063 0.253 1.306 0.125 0.272 0.751 0.185 0.445 0.031 0.201 0.263 0.168 0.015 0.074 0.129 0.181 0.005 0.115 0.127 BoNT/B complex substrate Anti mouse rMAb BoNT Result: - Clone 4E17.1 (PAN) ให้ผล weak positive กับ BoNT/B complex

Clone 4E17.1 (PAN) ให้ผล strong positive กับ BoNT/E complex 8/5/2016 - Coat BoNT/E complex 0.9 ng/ul - Conjugate anti mouse 1:3000 Dilution(ug/well) F1-2SL F1-2SP F1-2TL F1-2TP 4E17.1 Positive Blank 1.000 0.253 0.347 0.125 0.169 Out 0.081 0.500 0.176 0.235 0.110 0.133 0.250 0.141 0.162 0.093 0.109 0.117 0.140 0.090 0.096 2.671 0.078 0.062 0.121 0.159 1.820 0.080 0.031 0.104 0.099 0.088 0.089 1.170 0.086 0.015 0.098 0.087 0.727 0.005 0.094 0.100 2.863 0.404 BoNT/E complex substrate Anti mouse rMAb BoNT Result: Clone 4E17.1 (PAN) ให้ผล strong positive กับ BoNT/E complex F1-2SP > F1-2SL > F1-2TL,F1-2TP ให้ผล weak positive กับ BoNT/E complex

Clone 4E17.1 (PAN) ให้ผล weak positive กับ BoNT/F complex 8/5/2016 - Coat BoNT/F complex 0.15 ng/ul - Conjugate anti mouse 1:3000 Dilution(ug/well) F1-2SL F1-2SP F1-2TL F1-2TP 4E17.1 Positive Blank 1.000 0.159 0.173 0.137 0.114 0.253 Out 0.074 0.500 0.126 0.125 0.109 0.092 0.201 2.639 0.073 0.250 0.106 0.103 0.086 0.082 0.153 1.595 0.071 0.105 0.091 0.081 0.078 0.149 1.016 0.075 0.062 0.094 0.089 0.079 0.129 0.571 0.031 0.087 0.083 0.077 0.108 0.355 0.015 0.090 0.085 0.096 0.107 0.229 0.005 0.088 0.099 0.155 0.070 BoNT/F complex substrate Anti mouse rMAb BoNT Result: Clone 4E17.1 (PAN) ให้ผล weak positive กับ BoNT/F complex F1-2SP, F1-2SL > F1-2TL,F1-2TP ให้ผล weak positive กับ BoNT/F complex

ตารางการฉีดหนู @ ศูนย์สัตว์ทดลอง อาคาร 1 13/6/59 รับหนู 2-4 wk, เพศเมีย, 8 ตัว No. Date Action Immunogen Detail Remark   Bont A 1st 7-7-59 Inject Subcutaneous - Bont A HCR+HCT @ 20 ug + CFA 60 ul =total 120ul/ตัว 2nd 21-7-59 Inject IP - Bont A HCR+HCT + saline 20 ul + ICFA 60 ul =total 120ul/ตัว โดนหนูตัวที่ 6 กัดขนร่วง 3rd 4-8-59 เปลี่ยนไปกรงที่ 4 และเอาหนูกรง 4 มาแทนที่ 4th 18-8-59 - Bont A HCR+HCT + saline 20 ul + ICFA 60 ul =total 120ul/ตัว A/HCT 2.1 mg/ml 14.0 ul A/HCR 0.76 mg/ml 26.3 ul Saline 34.7 ul ICFA 75 ul  25-8-59 เจาะเลือด Check titer >1:128000 (OD HCR= 1.19) >1:128000 (OD HCT = 3.22) >1:128000 (OD toxin = 0.048) 12-9-59 15-9-59 การรุณยฆาต - Bont A HCR+HCT in saline No. Date Action Immunogen Detail Remark   Bont B 1st 7-7-59 Inject Subcutaneous - Bont B HCR+HCT @ 20 ug 2nd 21-7-59 Inject IP  - Bont B HCR+HCT @ 20 ug หนูก้าวร้าว กัดตัวที่ 5 ขนร่วงที่ปาก 3rd 4-8-59 B/HCT 1.36 mg/ml 14.7 ul B/HCR 0.61 mg/ml(ตะกอน) 49.3 ul Saline 11 ul ICFA 75 ul 4th 18-8-59 - Bont A HCR+HCT + saline 20 ul + ICFA 60 ul =total 120ul/ตัว  25-8-59 เจาะเลือด Check titer >1:128000 (OD HCR= 0.69) >1:128000 (OD HCT = 2.6) >1:128000 (OD toxin = 1.127) 8-9-59 Dead

Titer หนู immunize เข็มที่ 4 BoNT/A 1 ug/well rHCR rHCT Normal 12.5 ng/well Toxin A 1:1000 Out 0.026 2.374 0.011 1:2000 0.018 1.605 0.005 1:4000 0.998 1:8000 0.007 0.560 0.008 1:16000 3.781 0.316 0.006 1:32000 3.014 0.185 1:64000 1.997 3.948 0.100 1:128000 1.199 3.226 0.009 0.048 BoNT/B 1 ug/well rHCR rHCT Normal 90 ng/well Toxin B 1:1000 3.776 Out 0.089 0.011 1:2000 3.466 0.077 0.005 1:4000 3.253 0.075 0.006 1:8000 2.741 0.068 0.009 1:16000 2.33 3.724 1:32000 1.507 3.941 0.008 2.892 0.004 1:64000 1.085 3.489 1.793 1:128000 0.691 2.611 1.127