Implication of Ethanol Wet-bonding in Hybrid Layer Remineralization Kim et al., 2010

Introduction

Introduction This study tested the validity of this hypothesis by examining the extent of biomimetic remineralization in hybrid layers created by an etch-and-rinse adhesive under a spectrum of moisture conditions. The null hypothesis : no difference in the status of in vitro biomimetic remineralization in hybrid layers.

Materials and methods

Dentin bonding 15 extracted human third molars A flat dentin surface was prepare perpendicular to the longitudinal axis of each tooth by means of an Isomet saw (Buehle Ltd., Lake Bluff, IL,USA) under water-cooling.  second parallel cut along the CEJ to expose and remove the contents from the pulp chamber. The bonding surface was polished with 320 -grit silicon carbide paper, etched with 37% H3PO4 for 15 sec and rinsed with water for 10 sec. ใช้ฟันกรามซี่ที่สาม(third molar) 15 ซี่ ที่ได้รับการยินยอมจากผู้บริจาคและได้รับการอนุมัติจากคณะกรรมการประกันสิทธิมนุษย์ของมหาวิทยาลัยGroegia (the Human assurance committee of the medical college of Groegia) โดยผิวเนื้อฟัน(dentin) จะถูกเตรียมให้ตั้งฉากกับแกนตามยาวของฟันด้วยเครื่อง isomet ภายใต้ระบบน้ำเย็น ตัดขนานตามแนวของ CEJ ให้เปิดทะลุแล้วไป removed พวกอะไรใน pulp ออกมา

Dentin bonding Specimens were randomly devided into 3 groups. (N=5) 1) ethanol-wet-bonding [minimal water content] 2) water-wet-bonding [manufacturer’s recommended optimal water content] 3) water-overwet-bonding [excessive water content]

Dentin bonding Two coats of One-Step (Bisco) were applied and light- cured (600 mW/cm2) for 20 sec. Two 2-mm-thick incremental layers of resin composite were then applied and light-cured separately for 40 sec each. Each tooth was sectioned occluso-gingivally to produce four 1-mm-thick slabs (5x4=20 slabs/group).

Remineralization Medium White Portland cement was mixed with de-ionized water (water-to-powder ratio 0.35:1) and allowed to set in silicone molds for 1 wk before use. A biomimetic remineralization medium was prepared, consisting of a simulated body fluid (SBF) with 100-5000 μg/mL of polyacrylic acid polyvinylphosphonic acid Buffered to pH 7.4

Biomimetic Remineralization Each specimen slab was placed over a set Portland cement block inside a glass scintillation vial. The latter was filled with 15 mL of biomimetic remineralization medium and incubated at 37⁰C. The medium was changed monthly, with its pH monitored weekly so that it was above 9.25 to facilitate formation of apatite instead of octacalcium phosphate. (Meyer and Eanes, 1978)

Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) For each group, 4 slabs were immersed for 4 mos in the remineralization medium without Portland cement blocks. Each slab was ultrasonicated for 5 min and immersed in 0.1 wt% Rhodamine B dissolved in phosphatebuffered saline (pH = 7.4). After 24 hrs, the dye-infiltrated slabs were rinsed with de-ionized water and examined by a CLSM .

Transmission Electron Microscopy (TEM) The slabs were fixed in Karnovsky’s fixative, post-fixed in 1% osmium tetroxide. (1 hr) rinsed with sodium cacodylate buffer was dehydrated in an ascending ethanol series immersed in propylene oxide and embedded in epoxy resin examined 90-nm-thick unstained sections using a JEM-1230 TEM at 110 kV

Results

Fig.1 Ethanol-wet-bonding technique AC Specimens ถูก bonded ด้วย Ethanol-wet –bonding technique (มีปริมาณน้ำน้อย) A = adhesive (คือบริเวณที่อยู่ระหว่างลูกศรหัวเปิด) เป็นส่วน hybrid layer D = mineralized dentin base 1A. CLSM (Confocal Laser Scanning Microscope) image เป็น specimen ที่ถูกแช่ทิ้งไว้ 4 mos ใน remineralization medium (ตัวกลาง) ที่ปราศจาก Portland cement block (เช่น ไม่มีการ remineralization) ไม่มีการเรืองแสงจากบริเวณของ hybrid layer ทั้งหมด ส่วนตรงลูกศร คือ resin tag ซึ่งของกลุ่มนี้จะพบยาวกว่าในกลุ่มทดลองอื่นๆ 1B. TEM image ของ specimen ที่เอาขึ้นมาหลังแช่ไว้ 4 mos ที่ biomimetic remineralization ซึ่งไม่มีการ remineralizationของ hybrid layer เกิดขึ้น โดย electron-dense crystal ขนาดใหญ่ จะสามารถมองเห็นได้ในบริเวณ void (ตรงลูกศรหัวเปิด) ที่อยู่ไปตามพื้นผิวของ hybrid layer [Note :: การที่ไม่มี remineralization ที่ hybrid layer สามารถพบได้ใน specimen 10 ชิ้นจาก 16 ชิ้น หลังจากที่ผ่านไปแล้วสี่เดือน] 1C. เป็นภาพ TEM ของ specimen ที่เก็บหลังจากการทำ biomimetic remineralization 4 เดือน พบว่ามี mineralization เล้กน้อย ที่ hybrid layer บน dentin surface (ที่ลูกศรชี้) ซึ่งเป็นบริเวณใกล้เคียงกับ dentinal tubule (ตรงตัว T) ส่วน AC คือ composite ที่กลมกลืนไปกับ oxygen inhibition layer ของ adhesive หมายเหตุ : ภาพนี้เป็นการสังเกตใน specimen 6 อันจาก 16 อัน ในช่วงเวลาทั้งหมด 4 เดือน 1D. เป็นภาพ TEM กำลังขยายสูง ที่แสดงให้เห็น remineralization ใน intrafibril อย่างเดียว ซึ่งอยู่บนพื้นผิวของ collagen fibril ที่แสดงในภาพ C และส่วนลูกศรชี้ให้เห็น Electron-dense nanocrystallite ที่อยู่ภายใน fibril ที่มีการ remineralized แล้ว CLSM examination, fluorescence was completely quenched in hybrid layers from ethanol-wet-bonded specimens that were aged for 4 mos without the use of Portland cement as the calcium source (Fig. 1A) TEM examination, 62.5% of the specimens that were aged in the Portland cement-block- containing remineralization medium showed no signs of hybrid layer remineralization over the entire four-month period (Fig. 1B) Fig.1 Ethanol-wet-bonding technique

Fig.2 Water-wet-bonding technique

Fig.3 Water-overwet-bonding technique

Discussion

Discussion Water Ethanol maintain the structural integrity of collagen molecules. (Cameron et al., 2007) maintain mechanical properties of collagen fibrils. (Zhang et al., 2007). Ethanol remove innermost layer of structural water from the collagen fibrils. results in irreversible disruption of the triple-helical structure. (Magne et al., 2001).

Discussion Water-wet bonding the collagen matrix is suspended in water to prevent direct contact of the collagen fibrils (Pashley et al., 2007). (Mogilner et al., 2002). suspension of the collagen matrix in a liquid chemical dehydrant the dentinal tubule anastomosis the loosely bound water layers from the intrafibrillar compartments Increased intramolecular hydrogen bonding Shrinkage of fibrils (Miles and Ghelashvili, 1999).

Discussion Ethanol-wet bonding no biomimetic remineralization of the hybrid layers . replaced water from the interfibrillar compartment effectively. incompletely removed the loosely bound water from the intrafibrillar compartment of collagen fibrils around the tubular orifices. create durable resin-dentin bonds by replacing most of the water from the collagen matrix.

Discussion In the present study Ethanol-wet bonding is incapable of displacing water from the intrafibrillar compartment of the collagen matrix. Incomplete water replacement from the interfibrillar compartments. Dilution of water-soluble monomers with water Subsequent water sorption during aging Susceptibility of hybrid layers to interfibrillar remineralization

Discussion Water-overwet bonding Large mineral plates in the basal region of the filled water channels signify the absence of an appropriate scaffold for the deposition of nanocrystals. Conglomerates of apatite nanocystals within the cap region of the water channel probably represent hierarchical 3D precipitation of the mineral phase within a water- entrapped polymer hydrogel matrix. (Liu et al., 2009)

Discussion Identification of mineral platelets within the horizontally oriented water channels of the hybrid layer suggests that these channels were intricately connected to the vertical water channels on the hybrid layer surface, as confirmed in previous nanoleakage studies. (Tay et al., 2005a,b)

Discussion Mineral-filled water channels had never been identified within hybrid layers created with etch- and-rinse adhesives by conventional water-wet bonding technique. These channels represent the terminal branches of the dentinal tubule anastomosis and are continuous with the interfibrillar compartments of the collagen matrix. (Kim et al., 2010)

Discussion During adhesive application without perfusion, and with blot-drying, these terminal branches collapse due to shrinkage of the collagen matrix that is induced by the polar adhesive solvents with chemical dehydration potential. (Nakajima et al., 2002; Nalla et al., 2006; Becker et al., 2007)

Discussion The null hypothesis - no difference in the status of in vitro biomimetic remineralization in hybrid layers created by a two- step etch-and-rinse adhesive, regardless of the moisture condition under which they are created—is rejected.

คณะผู้จัดทำ นทพ.กุลวรัตน์ สิรินันทเกตุ 49610033 นทพ.กุลวรัตน์ สิรินันทเกตุ 49610033 นทพ.พฤกษชาติ พรวนคำ 49610316 นทพ.อภิชาติ นาคยา 49610576 นทพ.เพ็ญนภา บัวคำ 49610705 นทพ.อิศราภรณ์ ภมรสุพรวิชิต 50610230 นทพ.จิตเรขา สัมพันธรัตน์ 50610285 นทพ.พรพนิต ศิวเวทพิกุล 50610438 นทพ.กษมาภรณ์ รักอยู่ 50610698 นทพ.จงรัก นาคสีสุก 50610735 นทพ.ลลิตา คชายั่งยืน 50611039 นทพ.อทิตยา บุ่นวรรณา 50611107