การวางแผนการทดลองทางสัตว์ รศ.ดร.มนต์ชัย ดวงจินดา ภาควิชาสัตวศาสตร์ คณะเกษตรศาสตร์ มหาวิทยาลัยขอนแก่น

Contents Planning Experiments Basic Experimental Design Frequently asked question Some useful technique for treatment analysis Example and SAS usage Specific question for different species

ทำไมต้องทำการทดลอง? ตอบข้อสงสัย ขยายขอบเขตทางวิชาการ ค้นหาวิธีการใหม่ ปรับวิธีการเก่าหรือทดสอบหรือเปรียบเทียบกับสิ่งใหม่ พิสูจน์ทฤษฏี เพื่อยืนยันหรือล้มล้าง

STEPS IN PLANNING EXPERIMENT กำหนดปัญหา รวบรวมข้อมูล ตั้งวัตถุประสงค์ จัดเตรียมข้อมูล ค้นคว้าเอกสาร ทำการทดลอง วิเคราะห์ทางสถิติ กำหนดทรีทเมนต์ แปลผล กำหนดขนาดงานทดลอง เขียนรายงาน เลือกแผนการทดลอง นำใช้

ทำไมต้องวางแผน ? Ex งานทดลองหนึ่งผู้วิจัยต้องการทดสอบสารออกฤทธิ์ ขับปัสสาวะ 2 ชนิดในสุนัข ดังนี้ ค่าเฉลี่ย =250 =100 =160 เพศ พันธุ์ อายุ สาร ปัสสาวะ D 10 F 260 B 30 F 235 T 100 P 115 D 7 C 130 T 120 C 200 B 80 P 80 F: Furasimide P: เหง้าสับปะรด C: Control D=dulmation, B=boxer, T=Thai

ความสำคัญของการวางแผนการทดลอง หลีกเลี่ยงอิทธิพลพัวพัน เพื่อการสรุปผลที่แม่นยำ น่าเชื่อถือ เพื่อสะดวกในการจัดการ ทำให้สามารถเข้าใจเป็นสากล เป็นการสร้างงานทดลองที่มีคุณภาพและมีมาตรฐาน

องค์ประกอบหลักของงานทดลอง หน่วยทดลอง (Experimental units) ทรีทเมนต์ (Treatments) ซ้ำ (Replications) การสุ่ม (Randomization) การควบคุมความคลาดเคลื่อนงานทดลอง (Control of Experimental Error)

อัตราการเต้นของหัวใจ ทรีทเมนต์ ชนิดยา แบบเดี่ยว ค่าสังเกต อื่น ๆ ….. อัตราการหายใจ อัตราการเต้นของหัวใจ ทรีทเมนต์ ชนิดยา หน่วยทดลอง ค่าสังเกต อื่น ๆ ….. FCR ADG ทรีทเมนต์ สูตรอาหาร A,B,C แบบกลุ่ม

ประเภทของทรีทเมนต์ 1) ทรีทเมนต์คุณภาพ (Qualitative Treatment) - รูปแบบวิธีการ สูตรอาหาร สายพันธุ์จุลินทรีย์ สารเคมีชนิดต่างๆ 2) ทรีทเมนต์ปริมาณ (Quantitative Treatment) - ระดับยาปฏิชีวนะในสูตรอาหาร, อัตราเร็วของการให้น้ำเกลือ, ระยะเวลาในการเก็นน้ำเชื้อแช่แข็ง

การวิเคราะห์ค่าเฉลี่ยทรีทเมนต์ Multiple comparisons Orthogonal contrasts Orthogonal polynomials

Multiple Comparisons การเปรียบเทียบค่าเฉลี่ยแบบเป็นคู่ ไม่ควรใช้ หาก F-test จาก ANOVA ไม่พบนัยสำคัญ ตัวทดสอบแต่ละตัวให้ผลการทดสอบแตกต่างกันได้ LSD DUNCAN SNK TUKEY SCHEFFE Smallest Critical Value Highest Easy to Significant Easy to Non-Sig

Orthogonal Contrast ใช้ในกรณีที่ทรีทเมนต์สามารถจัดเป็นกลุ่มในการ เปรียบเทียบได้ เป็น Pre-Plan comparisons โดยใช้ตัวสถิติ F เป็นตัวทดสอบ ใน SAS ใช้ PROC GLM

Example การเปรียบเทียบอาหารโคนม 4 สูตร T1 = 16% CP (control) T2 = 16% CP + Monensin T3 = 16% CP + Virginiamycin T4 = 16% CP + Yeast T1 T2 T3 T4 T1 Vs T2,T3,T4 +3 -1 T2,T3 VS T4 +2 T2 Vs T3 +1

Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F PERIOD 1 0.0416667 0.0416667 0.01 0.9286 TRT 3 128.4583333 42.8194444 8.46 0.0009 **   Contrast DF Contrast SS Mean Square F Value Pr > F T1 VS T2,T3,T4 1 1.68055556 1.68055556 0.33 0.5711 T3 VS T2,T4 1 93.44444444 93.44444444 18.47 0.0004 ** T2 VS T4 1 33.33333333 33.33333333 6.59 0.0189 **

Orthogonal Polynomials ใช้ในกรณีที่ทรีทเมนต์เป็นค่าตัวเลขแสดงปริมาณ การเปรียบเทียบค่าเฉลี่ยแบบเป็นคู่ ไม่สามารถสรุปแนวโน้มการตอบสนอง (trend) ได้ ใน SAS ใช้ PROC GLM

Example การทดสอบการใช้ฮอร์โมน GnRH ต่อขนาดรังไข่ปลานิล T1 = 0 IU 10 20 30 นน.รังไข่

Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F GNRH 3 206394.0000 68798.0000 7.05 0.0055 **   Contrast DF Contrast SS Mean Square F Value Pr > F Linear 1 199200.8000 199200.8000 20.42 0.0007 ** Quadratic 1 6241.0000 6241.0000 0.64 0.0093 ** Cubic 1 952.2000 952.2000 0.10 0.7601

ลักษณะการจัดทรีทเมนต์ 1) Single factor การศึกษาเพียงปัจจัยเดียวในการทดลอง การใช้ embryo MEDIA TCM199 Whittingham H&P ปัจจัย (Factor) T1 T2 T3 การลด Aflatoxin Propronate ผึ่งแดด Control การใช้ antibiotic Streptomycin Oxytocin Tylosin การใช้วัคซีน rec-Vac con-Vac Control

กากถั่วเหลือง ปลาป่น 0% 2% 4% (a1) (a2) (b1) (b2) (b3) 2) Multifactor การศึกษาหลายปัจจัยร่วมกันในการทดลอง treatment ที่จะใช้จึงเป็น combination ของทุกปัจจัย 0% 2% 4% (b1) (b2) (b3) การเสริมไขมัน (Factor B) กากถั่วเหลือง ปลาป่น (a1) (a2) แหล่งโปรตีน (Factor A)

Treatment Combination SB=กากถั่วเหลือง FM=ปลาป่น Factor A Factor B Treatment a1 b1 a1b1 = T1 SB+ 0% FAT b2 a1b2 = T2 SB+ 2% FAT b3 a1b3 = T3 SB+ 4% FAT a2 b1 a2b1 = T4 FM+ 0% FAT b2 a2b2 = T5 FM+ 2% FAT b3 a2b3 = T6 FM+ 4% FAT

การอ่านผล factorial experiments Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F PROT 1 12.32450000 12.32450000 51.41 0.0001 ** FAT 2 0.08450000 0.08450000 0.35 0.5610 PROT*FAT 2 2.66450000 2.66450000 11.11 0.0042 ** Interaction significant ต้องแปลผลแยก เปรียบเทียบผลการเสริมไขมันแยกในแต่ละแหล่งโปรตีน %Fat SB FM

Replications ความสำคัญของ replication ประเมิน MSE – หากไม่มี rep , DF error = 0 เพิ่ม precision ให้กับค่าเฉลี่ยทรีทเมนต์ – การเพิ่ม rep ช่วยทำให้ค่า SEM ลดลง ค่าเฉลี่ยที่ได้มีความ ถูกต้องมากขึ้น ช่วยควบคุมความคลาดเคลื่อนงานทดลอง – ในกรณีที่เพิ่ม block จะช่วยลด MS(block) ออกจาก MSE เพิ่ม power of test – เพิ่มประสิทธิภาพการทดสอบ

การประเมิน Replications 1 Steel &Terri ต้องการ DF error > 9

การประเมิน Replications 2 Starting step กำหนดค่า CV และ DF(ERR) เริ่มต้นสำหรับ t-alpha และ t-power of test CV = coefficient of variation  = ความแตกต่างที่ต้องการ detect ได้ (% of mean 1-  = power of test  = ระดับนัยสำคัญ Iterative step นำค่าซ้ำที่ได้มาประเมินค่า DF(ERR) จากนั้นคำนวณซ้ำอีกครั้ง ทำจนกระทั่งได้ค่าซ้ำคงที่

EX ต้องการสร้างงานทดลอง CRD 4 ทรีทเมนต์ กำหนดลักษณะมี Cv=10%, ต้องการทดสอบพบความแตกต่างหาก ความแตกต่างมากกวา 20% Step1: ลองกำหนด DF(Err) = 9, t.025(9) = 2.69, t.80(9) = 0.261 Step 2: DF(Err) = t(r-1) = 4*(5-1) = 16, t.025(16) = 2.47, t.80(16) = 0.256

EX (‘Cont) Step 2: DF(Err) = t(r-1) = 4*(4-1) = 12, t.025(12) = 2.59, t.80(12) = 0.259 สรุปต้องใช้ rep เท่ากับ 4

Basic Experimental Design Group t-TEST Paired t-TEST Two Groups Continuous Trial Equal or Greater than Two Groups CRD, RCBD ANOVA Cross-over Trial Simple Cross-over, Latin Square Repeated Measurement Trial Split-plot in Time

t-TEST ใช้กับการเปรียบเทียบ 2 ทรีทเมนต์ การเลือกใช้ให้สังเกตว่า: Unrelated treatments => group t-TEST Related treatments => paired t-TEST การเลือกใช้ให้สังเกตว่า: 2 ทรีทเมนต์ ที่ศึกษาเป็นอิสระต่อกันหรือมีความสัมพันธ์กัน

E.U. = 10 TRT = 2 (T1 = Drug1, T2 = Drug2) T1 T2 Rep = 5 ตัว/TRT T1 T2 Group t-TEST Drug1 และ Drug2 อิสระต่อกัน

E.U. = 5 TRT = 2 (T1 = Normal, T2 = Stress) Rep = 5 ค่าสังเกต/TRT ทำให้เครียด T1 สภาพปกติ T2 สภาพเครียด Paired t-TEST ค่าสังเกตจาก T1 และ T2 มาจากหน่วยทดลองเดียวกัน

CRD แผนงานทดลองแบบสุ่มสมบูรณ์ (Completely Randomized Design) ใช้กับการเปรียบเทียบตั้งแต่ 2 ทรีทเมนต์ขึ้นไป หน่วยทดลองหรือสัตว์มีความสม่ำเสมอกัน จัดทรีทเมนต์ให้กับหน่วยทดลองอย่างสุ่ม

E.U. = 9 TRT = 3 (T1 = สูตร1, T2 = สูตร2, T3 = สูตร3) Rep = 3 ตัว/TRT T1 T2 T3 CRD T3 T1 T2 สูตร1, สูตร2 และ สูตร3 อิสระต่อกัน

MODEL: Yij = µ + Ti + Eij SOV DF TRT t-1 ERR t(r-1) TOTAL tr-1

RCBD แผนงานทดลองแบบบล็อกสมบูรณ์ (Randomized Complete Block Design) ใช้กับการเปรียบเทียบตั้งแต่ 2 ทรีทเมนต์ขึ้นไป สัตว์ที่ใช้สามารถแยกปัจจัยผันแปรได้ 1 อย่างที่สามารถจัดเป็นกลุ่มได้ก่อนให้ทรีทเมนต์ หน่วยทดลองต้องมีความสม่ำเสมอภายในบล็อก จัดทรีทเมนต์ให้กับหน่วยทดลองอย่างสุ่มภายในแต่ละบล็อก

E.U. = 9 TRT = 3 (T1 = Drug1, T2 = Drug2, T3 = Drug3) RCBD T1 T3 T2 T1 T2 T3 T2 T3 T1 Drug1, Drug2 และ Drug 3 ถูกสุ่มภายในแต่ละบล็อก

MODEL: Yij = µ + BKi + Tj + Eij SOV DF BLOCK b-1 TRT t-1 ERR (t-1)(b-1) TOTAL tb-1

Simple Cross-over Design แผนงานทดลองแบบเปลี่ยนสลับอย่างง่าย ใช้กับการเปรียบเทียบ2 ทรีทเมนต์ สัตว์แต่ละตัวจะได้รับทั้ง 2 ทรีทเมนต์ โดยมีการเปลี่ยนสลับใน period ถัดไป ดังนั้นจึงใช้เวลา 2 period

E.U. = 6 TRT = 2 (T1 = Feed1, T2 = Feed2) Period 1 T1 T2 Period 2 Simple Cross-over T1 T2 ค่าสังเกตจาก T1 และ T2 มาจากหน่วยทดลองเดียวกัน

Split-Plot Design แผนงานทดลองแบบสปลิทพลอท (Split plot Design) มี 2 ปัจจัย แต่มีการสุ่มทีละปัจจัยให้กับหน่วยทดลอง

E.U.(Main plot) = 9 A = 3 (A1 = สูตร1, A2 = สูตร2, A3 = สูตร3) A1 A2 A3 Split-Plot Main plot CRD Subplot B = 2 (B1,B2) A3 A1 A2 B1 B2 B2 B1 A1 B1 B2 B2 B1 A3 B2 B1 B1 B2 A2

MODEL: Yijk = µ + Ai + Err(a) +Bj + ABij + Eijk SOV DF A a-1 ERR(a) a(r-1) B b-1 AB (a-1)(b-1) ERR(b) ab*(r-1) TOTAL abk-1

Repeated Measurement Design แผนงานทดลองที่มีการวัดซ้า เป็นการวางแผนแบบ CRD หรือ RCBD ตามปกติ แต่มีวัดค่าสังเกตซ้ำเป็นระยะ เช่น ทุกสัปดาห์ ทุกเดือน ฯลฯ ใช้ข้อมูลทั้งหมดในการวิเคราะห์ ทำให้ทราบเพิ่มถึงการตอบสนองของแต่ละทรีทเมนต์เมื่อเวลาเปลี่ยนไป

T1 T1 T2 T2 Repeated Measurement WK1 WK2 WK3 WK4

Repeated measurement analysis Spherecity test for correlated error YES NO Multivariate Technique Wilk’s lambda statistics Split-plot in time Pseudo F adjusted by G-G or H-F method Regular Split-plot in time

T1 T2 Repeated Measurement WK1 WK2 WK3 WK4

Other Statistical Analysis in Animal Research Simple reg. Multiple reg. Regression Prediction Non-linear model, Time series model Chi-square Logistics model Categorical Data analysis Censor data Probit analysis Survival analysis Cluster analysis, discriminant etc.

EMAIL: monchai@kku.ac.th