AREE THATTIYAPHONG Ph.D. NIH, DMSc. 31 July 2014 Cholchon Hotel, Chonburi Technology for laboratory diagnosis

Response Innate Im.: interferon HIR: Antibody CMIR: effective cells, cytokine, Human specimens Antibody 1.Pathogens (Direct Detection) 2. Immune response (IgG, IgM) :Indirect detection Bacteria virus Infection Ingestion Inhalation Skin Invasion Laboratory Diagnosis of Microbs

Direct detectionIndirect detection Detect microbes or part of microbes Immune response (IgG, IgM) 1. Microscopic exam ; stainingAntibody detection 2. Cultivation-agglutination 3. Antigen detection-precipitation -agglutination, precipitation-RIA (Radio Immuno assay) -RIA, EIA, FA-EIA (Enzyme Immuno assay - ICT-Fluorescent assay 4. Genetic detection-ICT PRINCIPLE OF DETECTION

Methods for Direct Detection Detection of microbes or parts of microbes 1. Morphology by Microscopic examination Microscope (1590) : Hans Lippershey, Scharias Jansen Hans Jenssen (1668) Anthony Leewenhook TEM (1931) Max Knoll, Ernst Ruska SEM (1938) M. von Ardenne gram stain (1882 published 1884) Hans Christian Gram

2. Cultivation Standard method --

3. Antigen detection

4. Genetic Detection Polymerase chain reaction (PCR) in vitro system of making exponentially unlimited DNA copies from a single copy of DNA 3- steps with different temperatures, 1 cycle 1.Denaturation ( Denature double stranded- DNA into a single-stranded DNA 94 o -96 o C 2 Annealing (primers hybridize to complementary sequence on either site of single stranded-DNA, o C 3. Extension (polymerase enzyme binds and extends complementary DNA strands from each site of primers, 72 o C Detect amplified DNA product by gel electrophoresis, observe DNA size

Real-time PCR -Quantitative assay -Visualize amplification progress at any time - use fluorescent reporter molecule - SYBR Green dye, -Hybridization probe -TaqMan Probe -Molecular bacon probe -Scorpion probe No need to perform gel electrophoresis

Gene Sequencing, DNA sequencing 1acattgtgatgwcacagtctccactcactttgtcggttaccattggacaa 51ccagcctctatctcttgcaagtcaagtcagagcctcttacatagtaatgg 101aaaaacctatttgaattggttattacagaggccaggccagtctccaaagc 151gcctaatctatctcatgtctgaactggactctggagtccctgacaggttc 201actggcagtggatcagggacagattttacactgaaaatcagcagagtgga 251ggctgaggatttgggagtttattactgcgtgcaaggtacacattttcctc 301cgacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaa Process for determining nucleotide order of a given DNA fragment Use an automated DNA sequencer -Drug-resistant gene (virus) -identify pathogens Open House

การวิเคราะห์เชื้อในเครือข่ายฯ ชนิดเขื้อระดับที่ 1 ระดับที่ 2 ระดับที่ 3 ระดับที่ 4 B. anthracis - เก็บ ตัวอย่าง - ย้อมแกรม - ส่งต่อ - ย้อม แคปซูล - ย้อมสะ ปอร์ - ส่งต่อ - เพาะเชื้อ - ทดสอบ ความไว - ส่งต่อ - " Bamboo-stick" spore Polychrome Methylene Blue PA gene CAP gene M'Fadyean's reaction Cutaneous Pulmonary Gastrointestinal Injection

PLAGUE

ชนิดเขื้อระดับที่ 1 ระดับที่ 2 ระดับที่ 3 ระดับที่ 4 Y. Pestis (risk gr 3) - เก็บตัวอย่าง เลือด หนอง ฝี เสมหะ - ส่งต่อ - - ย้อม Gram, Wayson/ Giemsa - ส่งต่อ - เพาะเชื้อ 28/35 o C -PCR - ทดสอบ ความไว - ส่งต่อ - Bubonic plague Septicemic plague Capsular F1 Ag “flocculant” or “stalactite

ชนิดเขื้อระดับที่ 1 ระดับที่ 2 ระดับที่ 3 ระดับที่ 4 L. interogans - เก็บ ตัวอย่าง - ชุดทดสอบ (ICT, LA) - วิเคราะห์ แอนติบอดี ชนิด IgM ด้วยวิธี IFA, ELISA -PCR - ส่งต่อ - วิเคราะห์ แอนติบอดี ด้วยวิธี มาตรฐาน MAT - เพาะเชื้อ - ส่งต่อ

ชนิดเขื้อระดับที่ 1 ระดับที่ 2 ระดับที่ 3 ระดับที่ 4 Dengue virus - เก็บ ตัวอย่าง เลือด - ชุดทดสอบ ตรวจ Ag/Ab - ส่งต่อ -Real time PCR -PCR - ตรวจ anti- Dengue IgM/IgG ด้วยวิธี ELISA - เพาะเชื้อ ไวรัส - ตรวจลำดับ เบส -

ชนิดเขื้อระดับที่ 1 ระดับที่ 2 ระดับที่ 3 ระดับที่ 4 West Nile virus - เก็บ ตัวอย่าง เลือด CSF, - ส่งต่อ - ตรวจสาร พันธุกรรม ด้วย Real time PCR - ส่งต่อ --

THANK YOU FOR YOUR ATTENTION