Department of Microbiology in vitro Antigen and Antibody Interaction ผศ.นพ.สุวิน ว่องวัจนะ Department of Microbiology Faculty of Medicine Khon Kaen University

สำหรับ นศ.พ.ปี 2 จำนวน 1 ชั่วโมง วัตถุประสงค์ เพื่อให้นักศึกษา -ทราบถึงปัจจัยที่มีผลต่อการทำปฏิกิริยาระหว่าง Ag-Ab -ทราบถึงหลักการการทดสอบที่อาศัยหลักการการทำปฏิกิริยาระหว่าง Ag-Ab พร้อมทั้งการแปลผล การเรียนรู้เพิ่มเติม -ตำราวิชา immunology ทั้งภาษาไทยและอังกฤษ -ชีทประกอบการสอนเรื่อง Ag-Ab Reaction - http://mail.kku.ac.th/~suwin_wo/Lectures/lecture.html

1. Bonds: non-covalent bond Factors involved in Ag-Ab reaction 1. Bonds: non-covalent bond Electrostatic force (Coulombic force)-Difference charge Hydrogen bonding force - hydrophilic group  เช่น -OH, -NH2 , -COOH Hydrophobic force  - non-polar , hydrophobic group Van der Waals force - external  electron  clouds  

2. Structure: lock and key 3. pH: pH 7.2-7.4 Factors involved in Ag-Ab reaction 2. Structure: lock  and key 3. pH: pH 7.2-7.4 4. Temperature:    4-40 oC , optimum 37 oC 5. Ionic  strength: 0.15 M NaCl (0.9% NaCl) (isotonic solution) physiological salt solution, normal saline solution (NSS)

แบ่งตามปฏิกิริยาที่ใช้ในการทดสอบ 1. การลบล้างฤทธิ์ (neutralization) 2. การตกตะกอน (precipitation) 3. การจับกลุ่ม (agglutination) 4. อาศัยคอมพลีเมนต์  (complement dependent reaction) 5. อาศัยแอนติเจนหรือแอนติบอดีติดฉลากด้วยสาร ต่าง ๆ (labeled immunoassay)

1. ปฏิกิริยาลบล้างฤทธิ์ (Neutralization) with antibody (>--) no antibody 1. Unknown serum >- 2. Add known antigen Ag= no activity Ag = with activity (neutralized) (not neutralized)

1. ปฏิกิริยาลบล้างฤทธิ์ (Neutralization) 3. Add indicator cell ( =RBC) No lysis Lysis

1. ปฏิกิริยาลบล้างฤทธิ์ (Neutralization) Anti-streptolysin  O (ASO) test   Streptococcus pyogenes (b-Streptococcus group A) -Streptolysin O antigen Hemagglutination inhibition test (HI) Rubella, Influenza, Dengue etc. -hemagglutinating antigen  

2.  การตกตะกอน (Precipitation) Soluble Ag + Ab Ag-Ab complex (immune complex) Precipitation (ตกตะกอน)

2. การตกตะกอน (Precipitation) Lattice formation  Experiment: Increase Ag, Fix Ab concentration   1. Antibody  excess  zone (pro zone)  2. Equivalent zone 3. Antigen excess   zone  (post  zone)  

2. การตกตะกอน (Precipitation) Supernate free Ab Absence of free Free Ag Precipitate Ag + Ab Precipitate = Antigen Antibody = Ag excess Ab excess Equivalence Increasing amount of antigen รูปที่ 1 . แสดงลักษณะของปริมาณตะกอนที่เกิดขึ้นเมื่อเพิ่มแอนติเจน ในขณะที่ปริมาณแอนติบอดีมีคงที่

2.1 Precipitation in Gel ตัวกลางเป็น Semisolid media -เช่นวุ้น (gel) การแพร่ (diffusion)   “Immunodiffusion”

2.1 Precipitation in Gel ใส่ Ag ใส่ Ab 2.1.1 Double immunodiffusion (Ouchterlony's method) ตรวจหาแอนติเจนหรือแอนติบอดี กระจกสไลด์ เคลือบวุ้น เจาะรู ใส่ Ag ใส่ Ab

2.1.1 Double immunodiffusion (Ouchterlony's method) precipitin band, precipitin line เส้นตะกอน ใส่ Ag ใส่ Ab

2.1.1 Double immunodiffusion (Ouchterlony's method) บอกความเหมือนหรือต่างกันของแอนติเจนต่าง ๆ ได้อย่างคร่าว ๆ ใส่ Ag1 ใส่ Ag2 ใส่ Ab 3 1 2 Line of identity 4 5 6 9 7 8 Line of partial identity Line of non-identity

2.1.2 Single radial immunodiffusion, SRID (Mancini's method) ใช้หาปริมาณของ unknown Ag Ab in gel 15 10 5 Unknown

2.1.2 Single radial immunodiffusion, SRID (Mancini's method) diameter (d) 15 10 5 unknown Standard antigen (mg/ml)

2.1.2 Single radial immunodiffusion, SRID (Mancini's method) Antigen concentration 5 10 15 20 d 2

2.2 การตกตะกอนในเนื้อวุ้นร่วมกับelectrophoresis 2.2.1 Immunoelectrophoresis (IEP) (-) (+) หลุมใส่ Ag (-) (+)

2.2.1 Immunoelectrophoresis (IEP) Trough (ร่องใส่ Ab) Precipitin band, precipitin arc ใช้บอกความผิดปกติของแอนติเจนได้ เช่น ความผิดปกติของอิมมูโนโกลบุลิน

2.2.1 Immunoelectrophoresis (IEP) Patient serum Normal serum

(+) (-) 2.2.2 Counter immunoelectrophoresis (CIE) เส้นตะกอนที่เกิดขึ้น ใส่ Ab ใส่ Ag ใช้ตรวจหา Ag, Ab เช่น HBsAg ( ถ้ามี anti-HBsAg อยู่แล้ว) anti-HBsAg (ถ้ามี HBsAg อยู่แล้ว) bacterial antigen (H.influenzae, Streptococcus )ใน CSF

+ 3. Agglutination Agglutination Ab Ag เป็นอานุภาค (particulate antigen) Y Agglutination Y

+ + 3. Agglutination 3.1 Direct หรือ Active agglutination (หาAb ) Ab + Self Ag on particle or cells + Y Y 3.2 Indirect หรือ passive agglutination (หา Ab) Ab + Coated Ag on particle or cell + Y Y

+ 3. Agglutination 3.3 Reverse passive agglutination (หา Ag) Coated Ab + Ag Y Y +

3. Agglutination เป็นเม็ดเลือดแดงจะเติม hem- ไว้ข้างหน้า เป็น -passive  hemagglutination, -reverse passive hemagglutination เป็น latex เรียก latex agglutination เป็น cell เรียก cell agglutination

4. Complement dependent reaction Complement fixation test (CF) -สำหรับตรวจหาแอนติเจนหรือแอนติบอดี SRBC Anti-SRBC Ag Ag SRBC Anti-SRBC Y C’ C’ No Ab Ab Y IndicatorSystem IndicatorSystem Test system Test system

ตรวจหา Ab 1. ใส่ serum ผู้ป่วย 2. ใส่ antigen( ) 3. ใส่ complement( ) -ve Y Y +ve 1. ใส่ serum ผู้ป่วย Y Y 2. ใส่ antigen( ) Y Y 3. ใส่ complement( ) Y No Lysis Y Lysis 4. ใส่ indicator system (SRBC+anti-SRBC)

5. Labeled Immunoassay เพิ่มความไว (sensitivity) ของการทดสอบ (สามารถตรวจสอบสารที่มีปริมาณน้อย ๆ ได้) Label with * fluorescent  dye * enzyme * isotope (radioactive substance)

5. Labeled Immunoassay Immunofluorescence (IF) - fluorescent microscope Enzyme immunoassay (EIA) -Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) -ใส่ substrate ให้เอ็นซัยม์ย่อยแล้วดูสีที่เปลี่ยนแปลง Radioimmunoassay (RIA) -ใช้เครื่องมือที่สามารถวัดปริมาณสารกัมมันตรังสี

5. Labeled Immunoassay F*** E*** R*** Labelled Ab Speciific Ag Immunofluorescence Enzyme immunoassay Radioimmunoassay

5. Labeled Immunoassay ไตเตอร์ (titer, titre) เป็นค่าที่บอกถึงความเจือจางสูงสุดขอสิ่งส่งตรวจนั้น ๆ ซึ่งยังมีแอนติบอดี  (หรือแอนติเจน) ปริมาณมากพอที่จะก่อให้เกิดปฏิกิริยาให้ตรวจสอบได้

5. Labeled Immunoassay เช่น ในการตรวจหาแอนติบอดีในซีรัมผู้ป่วย พบว่าเมื่อเจือจางซีรัมจาก 1:2, 1:4, 1:8 ...จนถึง 1:16 ยังคงให้ผลบวก แต่ที่ความเจือจาง 1:32 ให้ผลการทดสอบเป็นลบแล้ว แสดงว่าในซีรัมมีแอนติบอดีไตเตอร์เท่ากับ 1:16 ค่าไตเตอร์บางครั้งก็รายงานเป็นส่วนกลับของความเจือจางสูงสุดที่ยังคงให้ผลการทดสอบเป็นบวกอยู่  เช่น ไตเตอร์ 1:16 บางครั้งอาจเขียนว่ามี ไตเตอร์เท่ากับ 16 ก็ได้

Good Luck