การสกัดและแยกสารผลิตภัณฑ์ธรรมชาติ EXTRACTION AND ISOLATION OF NATURAL PRODUCTS อาจารย์ ดร.เฉลิมพร ทองพูน สาขาวิชาเคมี คณะวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี มหาวิทยาลัยราชภัฏพิบูลสงคราม e-mail : cthongpoon@gmail.com

หัวข้อ บทนำ การเก็บพืชสมุนไพร การแปรสภาพสมุนไพร การย่อยขนาดสมุนไพร การทำสารสกัดให้เข้มข้น การแยกส่วนผสมด้วยเทคนิคต่างๆ Partition extraction, Liquid-liquid extraction, Distillation, Crystallization, Chromatography (TLC, Column chromatography Modern separation method)

วัตถุประสงค์ Δ ทราบขั้นตอนต่างๆในการแยกสารบริสุทธิ์จากพืชสมุนไพร Δ ทราบขั้นตอนต่างๆในการแยกสารบริสุทธิ์จากพืชสมุนไพร Δ ทราบขั้นตอน และวิธีที่เหมาะสมในการเตรียมพืชก่อนการสกัด Δ ทราบวิธีการสกัด และเลือกวิธีการสกัดได้เหมาะสมกับพืชสมุนไพร Δ ทราบเทคนิค และเครื่องมือชนิดต่างๆที่ใช้ในการแยกสกัดสาร Δ ได้แนวคิดในการเรียนรู้งานวิจัยทางพฤกษเคมี (Phytochemistry)

Phytochemistry วิชาที่ศึกษาการแยกสารบริสุทธิ์จากพืช

MODERN PHARMACOGNOSY อดีต Microscopic or Macroscopic Identification ☺ Organized or cellular Products - Fresh plant Material - Dried plant Material ☻ Unorganized or acellular Products (resin, balsam, volatile oil) ☼ Galenical Preparation Natural Product อดีต Modern Pharmacognosy Microscopic or Macroscopic Identification Plant Material Preparation Extraction Maceration, Percolation, Soxhlet extraction, Phytochemical screening Concentration of extract Free evaporation, distillation in vacuo, lyophilizer

MODERN PHARMACOGNOSY By Chemical and Physical separation Concentration of extract Separation By Chemical and Physical separation Classical method : distillation, sublimation, crystallization Modern method : adsorption and partition chromatography, ion exchange, electrophoresis, gel filtration Identification By Chemical and Physical separation M.P., optical rotation Paper, TLC chromatography GC, HPLC UV, IR Spectroscopy MS, NMR Structure elucidation

Phytochemistry Literature survey วิชาที่ศึกษาเกี่ยวกับการสกัดแยก สารบริสุทธิ์จากพืช (พฤกษเคมี) Phytochemical study Screening extraction isolation and purification structure elucidation Literature survey Pharmacological screening Toxicology Pharmaceutical Preparation Marketing Research Clinical Trial Monitoring

รูปแบบของพืชที่ใช้เป็นยา Fresh Plant Material 2. Dried Plant Material 3. Acellular product 4. Galenical Preparation 5. Pure compound ขั้นตอนการพัฒนาพืชเพื่อให้ได้สารบริสุทธิ์ทางยา Plant Material Preparation Extraction Concentration Separation Identification

การเตรียมตัวอย่างพืช แหล่งตรวจสอบพันธุ์ไม้ ตัวอย่างพันธุ์ไม้ที่ได้รับการตรวจสอบ และพิสูจน์แล้ว ว่าเป็นชนิดนั้นจริง ( Voucher specimen number ) In Thailand - หอพรรณไม้ กรมป่าไม้ บางเขน กทม. -กองวิจัย และพัฒนาสมุนไพร, กรมวิทยาศาสตร์การแพทย์ (กระทรวงสารารณสุข) จ.นนทบุรี - มหาวิทยาลัยที่มี herbarium ของพืชอยู่

การเก็บพืช ปัจจัยที่มีผลต่อปริมาณสารในพืช ชนิดของพืช (species) สภาพแวดล้อม (environmental) เทคนิคการปลูก และบำรุงรักษา (cultural technology) ช่วงเวลาการเก็บ (harvesting peroid) วิธีการเก็บรักษา (storage) วิธีการแปรรูป (processing)

หลักในการเก็บพืชสมุนไพร ราก และหัว พืชหยุดการเจริญ (ต้นโทรมหมดแล้ว), อายุหลังปลูก 8-10 mo. 2. เปลือกราก และลำต้น ปลายฤดูร้อน ต่อฤดูฝน 3. ดอก ดอกตูม, เริ่มบาน ขณะอยู่บนต้น 4. ผล และเมล็ด ผลแก่จัด ยกเว้นบางชนิดอาจใช้ผลดิบ เช่น ฝรั่ง, มะเกลือ 5. สมุนไพร มีกลิ่นหอม เช้ามืด, อากาศเย็น

การทำสมุนไพรให้แห้ง ผึ่งลมในที่ร่ม เช่น ดอกไม้ที่มีกลิ่นหอม ผึ่งลมในที่ร่ม เช่น ดอกไม้ที่มีกลิ่นหอม 2. ผึ่งแดดให้แห้ง 3. ต้ม หรือนึ่ง แล้วทำให้เย็น เช่น สมุนไพรที่มีแป้ง, ขมิ้น, ขิง 4. อบด้วยตู้อบ (ควบคุมอุณหภูมิได้แน่นอน) 4.1 ดอก, ใบ, ทั้งต้น (พืชล้มลุก) ไม่เกิน 40 °C 4.2 ราก, กิ่ง, เปลือก ไม่เกิน 65 °C 4.3 ผล และ เมล็ด 70-90 °C 4.4 สมุนไพรที่มี V.O. 25-30 °C

การย่อยขนาดสมุนไพร (Mechanical Method) Electric blender (เครื่องปั่นไฟฟ้า) 2. Hammer mill 3. Rotary cutter mill

การสกัดสารสำคัญจากพืช REFLUX

MACERATION Circulatory maceration

PERCOLATION PERCOLATOR

SOXHLET EXTRACTOR

LIQUID-LIQUID EXTRACTION Extractant lighter Raffinate lighter

Extraction of volatile oil Steam Distillation Clevenger Apparatus

อำนาจการละลายดีพอควร ไม่ระเหยง่าย หรือยากเกินไป การเลือกใช้ตัวทำละลาย อำนาจการละลายดีพอควร ไม่ระเหยง่าย หรือยากเกินไป ไม่ทำปฏิกิริยากับสารที่ต้องการสกัด ไม่เป็นพิษ ราคาพอสมควร ตัวทำละลายที่นิยมใช้ คลอโรฟอร์ม อีเทอร์ เฮกเซน แอลกอฮอล์

Solvent polarity (E°)

การทำสารสกัดให้เข้มข้น Free evaporation Reduce pressure evaporator (Rotary evaporator) Freezing (Freeze dryer, lyophilizer)

การแยกส่วนผสม Partition extraction Chemical reaction Physical mean Distillation Sublimation Crystallization

หลักการ : กระจายตัวของสารใน 2 phase (SP, MP) CHROMATOGRAPHY หลักการ : กระจายตัวของสารใน 2 phase (SP, MP) ที่ไม่ผสมเป็นเนื้อเดียวกัน Move : interaction of solute and SP interaction of solute and MP ถ้ามี interaction กับ solute ดี, solute จะ move ช้า

Process interaction Stationary phase 1. Adsorption 2. Absorption 3. Partition 4. heteropolar bond with ion of SP 5. volatility Stationary phase Solid, liquid

1. Silica gel (Kieselgele)

2. ALUMINA 3. DIATOMACEOUS EARTH 4. CELLULOSE 6. CLAY 5. CHARCOAL 7. POLYAMIDE 8. RESIN

การเลือก ADSORBENT คุณสมบัติการละลายของสาร ความเป็นกรด ด่าง หรือเป็นกลาง ของสารที่จะแยก ปฏิกิริยาระหว่าง Ads กับ solute หรือ solute กับ MP Hydrophilic ; cellulose, kieselguhr, polyamide Hydrophobic ; alumina, silica gel, acetylated polyamide

การแบ่งชนิด chromatography MP & SP Mechanism of retention 2.1 Sorption MOBILE PHASE Isocratic Gradient การแบ่งชนิด chromatography MP & SP Mechanism of retention 2.1 Sorption Adsorption & Partition chromatography 2.2 Exclusion 2.3 Ion exchange

2.3 Ion exchange

TLC (Thin layer chromatography) ข้อดีกว่า PC ใช้เวลาน้อยกว่า, ไม่มี fiber, ใช้ตัวอย่างน้อยกว่า ทนต่อน้ำยากัดกร่อน ชนิดของ TLC Microscopic slide Macrolayer TLC Preparative TLC Adsorbent for TLC Binder Gypsum (G) Starch (S) Silicon dioxide (H) สารเรืองแสง (phosphor, F)

การแบ่งชนิด chromatography 3. แบ่งตามเทคนิค Column chromatography Open –bed chromatography 4. แบ่งตามการนำไปใช้งาน Analytical Chrom. Preparative Chrom.

ชนิดของ TLC Microscopic slide TLC ; qualitative Macrolayer TLC ; 5x20, 10x20, 20x20 c.m., หนา 0.25 mm qualitative + quantitative Preparative TLC ; หนา 2 mm , quantitative

Preparative TLC

การเตรียม TLC Microscopic slide TLC ; (ใช้ organic solvent แทนน้ำ) Macrolayer TLC ; clean plate (detergent,alc and acetone) slurry of Ads : water (1:2), silica gel เคลือบบนแผ่นแก้ว - Pouring Procedure (เท+ กลิ้ง) - Imersion P. (จุ่ม, small plate) - Spreading (Fixed or movable spreader) - Spraying P. อบใน ตู้อบ 110 °C, 30 นาที, เก็บใน dessicator

Application of sample Solution 0.1-1% in organic solvent, spot 1-10 µl spot เล็กไม่เกิน 2.5 mm กรณี preparative TLC ; spot ติดกันเป็นแถบ หรือ streak (1ul-1ml)

Development In saturated tank

Visualizing agent General detecting agent H2SO4 10-30% in alcohol I2 vapor 2. Specific reagent eq. dragendorff Qualitative analysis Rf hRf Rr

Tailing Suppress acid or base Change solvent Dilute

Quantitative TLC การประยุกต์ใช้ TLC I. On TLC plate Densitometer Fluorescence Reflectance II. Elution Method การประยุกต์ใช้ TLC ทราบจำนวนสาร หา solv. System for column ตรวจ fraction จาก column แยกสารปริมาณน้อย แยกสารที่คอลัมน์แยกไม่ได้ หาปริมาณสารผสม

C A B MP ; CHCl3-EtOAc 3:7, 7:3

CHCl3:EtOAc (7:3) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Normal Phase Reverse phase

4 32 1 1+4 3 1+4 1 2 3 4 MP ; CHCl3-EtOAc, 7:3

Classical Column Chromatography diameter:length, 1:10, 1:100 Sample : adsorbent (1:30) II. Packing Dry packing Wet packing

Sample preparation Flow rate of column ละลายด้วย solvent II. คลุกกับ silica Flow rate of column ปรับตามความเหมาะสม Developing solvent Grade ที่ใช้ นิยมใช้ gradient elution

Other column chromatography LPLC Short CC Flash CC HPLC การแยกสารปริมาณน้อย เริ่ม pure Recrystalization Preparative TLC HPLC

UV, IR, NMR, MS, X-ray crystallography Identification TLC หลายระบบ solvent syst I. Physical Properties MP. (กรณี solid) II. Spectroscopy UV, IR, NMR, MS, X-ray crystallography

Compound K3 (C3H6O3S2) Colorless crystal [α]20D 0°(c 0.10, CHCl3) UV (MeOH) λmax (log ε) , 283.5 (1.58), 285.5 (1.57) nm IR (film) 3471.7 cm-1 (OH) 2916.8 cm-1 (C-H stretching) 1125.2, 1298.8 cm-1 (SO2 stretching) HRESIMS m/z 176.9587 [M+Na]+ (calcd for C3H6O3S2Na, 176.9656)

H5 H3 OH H4 Compound K3 J=12.94, 3.11 J=12.94, 5.44 J=12.13, 3.87 HMBC COSY

DEPT-135 13C-NMR 1, 1-dioxo-1-λ6[1, 2] dithiolane-4-ol Compound K3 45.20 65.09 68.37 13C-NMR DEPT-135 C3 C5 C4 1, 1-dioxo-1-λ6[1, 2] dithiolane-4-ol “ Bruguiesulfurol ”

เอกสารอ้างอิง วันดี กฤษณพันธ์. ยา และผลิตภัณฑ์จากธรรมชาติ เล่ม 1. ภาควิชาเภสัชวินิจฉัย คณะเภสัชศาสตร์ มหาวิทยาลัยมหิดล. พิมพ์ครั้งที่ 2, คณะเภสัชศาสตร์ มหาวิทยาลัยมหิดล: กทม., 2536. อ้อมบุญ ล้วนรัตน์. การสกัด และตรวจสอบสารสำคัญจากผลิตภัณฑ์ธรรมชาติ. คณะเภสัชศาสตร์ มหาวิทยาลัยมหิดล: กทม., 2536. ภาควิชาเภสัชเวท คณะเภสัชศาสตร์ มหาวิทยาลัยศิลปากร. การสกัด และตรวจสอบเบื้องต้นทางพฤกษเคมี.