นางสาวดรุณรัตน์ แก้วมูล รหัสนักศึกษา 51312305 นางสาวดรุณรัตน์ แก้วมูล รหัสนักศึกษา 51312305 สถานที่ทำงาน โรงพยาบาลศิริราช ภาควิชานิติเวช สาขาวิชานิติพิษวิทยา ตำแหน่ง ผู้ปฏิบัติงานวิทยาศาสตร์การแพทย์

อาจารย์ ดร. ศุภชัย ศุภลักษณ์นารี อาจารย์ที่ปรึกษา อาจารย์ ดร. ศุภชัย ศุภลักษณ์นารี

Long-term stability of various drugs and metabolites in urine, and preventive measures against their decomposition with special attention to filtration sterilization.

ของยาในปัสสาวะและมาตรการป้องกัน ไม่ให้ยาเกิดการสลายตัวโดยเฉพาะด้วย ความคงตัวระยะยาวและMetabolite ของยาในปัสสาวะและมาตรการป้องกัน ไม่ให้ยาเกิดการสลายตัวโดยเฉพาะด้วย การกรองแบบปราศจากเชื้อ

Author Kei Zaitsu Akihiro Miki Munehiro Katagi Hitoshi Tsuchihashi

ปัญหาในการตรวจวิเคราะห์ยาและสารเสพติดในสิ่งส่งตรวจประเภทปัสสาวะ - การปนเปื้อนแบคทีเรียและการเสื่อมสภาพของปัสสาวะ - วิธีการเก็บรักษาสภาพสิ่งส่งตรวจประเภทปัสสาวะ - การสลายตัวของยาและสารเสพติดในปัสสาวะ การพัฒนาวิธีการเก็บสิ่งส่งตรวจประเภทปัสสาวะเพื่อตรวจวิเคราะห์ยาและสารเสพติด - Aseptic Collection Kit - การเติม Sodium azide (สารกันบูด) - อุณหภูมิ

ผู้ต้องหา/ผู้เสียหาย ความเป็นมา ผู้ต้องหา/ผู้เสียหาย มีสิทธ์ร้องขอให้มี การตรวจวิเคราะห์ซ้ำ

ผลการตรวจวิเคราะห์น่าเชื่อถือ การตรวจวิเคราะห์ซ้ำ ครั้งแรก = ครั้งหลัง ผลการตรวจวิเคราะห์น่าเชื่อถือ

ผลการตรวจวิเคราะห์ไม่น่าเชื่อถือ การตรวจวิเคราะห์ซ้ำ ครั้งแรก = ครั้งหลัง ผลการตรวจวิเคราะห์ไม่น่าเชื่อถือ

Forensic Urine sample Unknown Drug / Concentration Contaminate More/Less Infection/natural Collect Non aseptic Transport Expose to ambient temperature

Expose to ambient temperature Effect bacteria ผลการตรวจ ครั้งแรก = ครั้งหลัง

ผลการตรวจวิเคราะห์ไม่น่าเชื่อถือ การตรวจวิเคราะห์ซ้ำ ครั้งแรก = ครั้งหลัง ผลการตรวจวิเคราะห์ไม่น่าเชื่อถือ Critical Cut off

1 ng / ml 1 2

Drug Methamphetamine (MA) Cocaine (COC) Estazolam (EZ) 6-acetylmorphine (6AM) 7-aminoflunitrazepam (7AF) Amphetamine (AP) Nitrazepam (NZ)

Drug detected in urine unchanged forms MA COC EZ

metabolites of grate forensic Drug metabolites of grate forensic proof of intake of their parent drugs AP 6AM and 7AF

Drug readily decomposed by bacteria indicator of bacteria propagation NZ

common ester-type drug และ metabolite ที่จะ hydrolyzed ได้ COC and 6AM

quadrupole mass spectrometer Shimadzu LCMS-QP2010 HPLC quadrupole mass spectrometer

Experimental

เก็บปัสสาวะจากอาสาสมัคร 24 คน เก็บปัสสาวะจากอาสาสมัคร 24 คน ชาย =12 หญิง =12 (18 – 58 ปี) ตรวจนับจำนวน bacteria Standard Methods of Analysis in Health Scienc

Sample ปนเปื้อนน้อย ปนเปื้อนรุนแรง หญิง 29 ปี ชาย 27 ปี 10,000,000 cell ชาย 27 ปี 1900 cell ปนเปื้อนน้อย ปนเปื้อนรุนแรง

Sample ความเข้มข้น 500 ng/mL MA AP NZ EZ 7AF COC 6AM

เฉพาะ EZ, NZ และ 7AFเก็บไว้ในที่มืด Sample กรอง 25˚C NaN3 0.5 wt% 6 เดือน MA AP - NZ - EZ - 7AF - COC - 6AM 4˚C กรอง+NaN3 -20˚C ไม่ใส่ เฉพาะ EZ, NZ และ 7AFเก็บไว้ในที่มืด

ชุดกรองปัสสาวะปราศจากเชื้อ

ทดสอบประสิทธิภาพชุดกรองปัสสาวะปราศจากเชื้อ ปัสสาวะ 24 คน กรองด้วยชุดกรอง LB (Luria-Bertani) media ไม่พบ Bacteria

Sample ปัสสาวะ 600 ul IS 10 ug/mL DBA ปริมาณ 30 ul กรองผ่าน membrane 0.45 um

Results

Selectivity Table 1.doc Fig 2 obtained by the automated on-line extraction LC–MS of seven drugs and metabolites in urine at 500 ng/mL each

Stability of MA and AP Fig. 3. Time-course changes in the concentrations of MA and AP in the severely contaminated urine under various storage conditions ((●) with filtration, at 25 °C; (♦) with NaN3, at 25 °C; (■) without any preservative measures, at 25 °C; (○) with filtration, at 4 °C; () with NaN3, at 4 °C; (□) without any preservative measures, at 4 °C).

Stability of MA and AP MA ลดลง 32 % AM ลดลง 44 % Fig. 3. Time-course changes in the concentrations of MA and AP in the severely contaminated urine under various storage conditions ((●) with filtration, at 25 °C; (♦) with NaN3, at 25 °C; (■) without any preservative measures, at 25 °C; (○) with filtration, at 4 °C; ( ) with NaN3, at 4 °C; (□) without any preservative measures, at 4 °C).

ยับยั้งการสลายตัวของMAและAM aseptic collection kit NaN3

4 ราย ไม่มีการเปลี่ยนแปลง ศึกษาเพิ่ม เก็บที่ 25 C/150 วัน 5 ราย 1 ราย MA 60 % AM 23 % 4 ราย ไม่มีการเปลี่ยนแปลง

ยับยั้งการสลายตัวของสาร aseptic collection kit NaN3

ทดสอบ MA เปลี่ยนฟอร์มเป็น AM Enzyme

ศึกษาเพิ่ม LC-MS เก็บที่ 25˚C 30 วัน MA ความเข้มข้น 500 ng/mL No trace AM MA เก็บที่ 25˚C 30 วัน

Stability of MA and AP การลดลงของ MA และ AM เกิดจาก Bacteria ทำปฏิกิริยา reductive กับ Nitrogen biological แยก carbon – carbon bonds Amine

Stability of MA and AP ดังนั้นการสูญเสีย MA และ AM เป็นไปได้ว่าเกิดจากการ Break carbon – carbon bonds โดย Bacteria

ผลการวิจัย Clauwaert et al 3,4-methylenedioxy derivatives of MA and AP Urine without preservative room temperature MA and AP มีความคงตัวอยู่ได้ถึง 21 weeks

Stability of NZ and EZ Fig. 3. Time-course changes in the concentrations of NZ and EZ in the severely contaminated urine under various storage conditions ((●) with filtration, at 25 °C; (♦) with NaN3, at 25 °C; (■) without any preservative measures, at 25 °C; (○) with filtration, at 4 °C; () with NaN3, at 4 °C; (□) without any preservative measures, at 4 °C).

Stability of NZ and EZ -20˚C / 150 วัน /All NZ and EZ ไม่เปลี่ยนแปลง ปนเปิ้อนรุนแรง /25˚C / 14 วัน / no preserve ตรวจไม่พบ NZ ปนเปิ้อนเล็กน้อย/ 25˚C / 14 วัน / no preserve NZ ค่อยๆลดลงช้าๆ ช้ากว่า 5 เท่า

Stability of NZ and EZ Oxygen-sensitive enzyme จาก Bacteria จะทำปฏิกิริยา reducing กับ nitroaromatic compounds amine NZ เป็นสารพวก nitrobenzodiazepienes เปลี่ยนรูปเป็น 7-amino-metabolites โดย bacteria ( bacteria in the gastrointestinal tract reduction nitrobenzene )

detected 7- aminonitrazepam which losses of NZ were detected. Stability of NZ and EZ detected 7- aminonitrazepam in all the samples in which losses of NZ were detected.

Stability of NZ and EZ Robertson and Drummer reported NZ was stable up to 24 months when samples were stored at 4 C

ป้องกันการสลายตัวของ NZ aseptic collection kit NaN3

Stability of 7AF Fig. 5. Time-course changes in the concentration of 7AF in the severely contaminated urine under various storage conditions (●) with filtration, at 25 °C; (♦) with NaN3, at 25 °C; ( ) with filtration and NaN3, at 25 °C; (■) without any preservative measures, at 25 °C; (○) with filtration, at 4 °C; (♦ ) with NaN3, at 4 °C; ( ) with filtration and NaN3, at 4 °C; (□) without any preservative measures, at 4 °C).

Stability of 7AF NaN3 + กรอง / ยับย้งการสลายตัวของ 7AF ได้ดีที่สุด - 20˚C / 150 วัน /7AF ไม่เปลี่ยนแปลง ปนเปื้อนรุนแรง/ ปนเปื้อนเล็กน้อย / 150 วัน/ สูญเสีย 7AF เล็กน้อยเหมือนกัน กรอง / สูญเสีย 7AF เล็กน้อยเหมือนกัน NaN3 / สูญเสีย 7AF ปานกลางเหมือนกัน NaN3 + กรอง / ยับย้งการสลายตัวของ 7AF ได้ดีที่สุด

ทดสอบ การ Adsorption 7AF บนผิวหน้าของ Vessel

ทดสอบ Adsorptions A B C D 7AF แต่ละความเข้มข้น (250 – 2000 ng/mL) กรองด้วยชุดกรอง เก็บไว้ 30 วัน

ทดสอบการ Adsorption 7AF ลดลง ไม่ขึ้นอยู่กับความเข้มข้นของสาร 100 ng/mL ในทุกความเข้มข้นของสารแต่ละความเข้มข้น (A B C D) 7AF ลดลง ไม่ขึ้นอยู่กับความเข้มข้นของสาร

Adsorption ที่ผิวหน้าของ Vessel 7AF ลดลง เกิดจากการถูก Adsorption ที่ผิวหน้าของ Vessel

Stability of 7AF ลดลงเองตามธรรมชาติ เพราะตัวมันเองไม่ stable Robertson and Drummer : Normal blood /4, 22 and 37 C / sodium fluoride สูญเสีย 7AF 10% ในระยะเวลา 28 วัน bacteria-contaminated blood /22 C. สูญเสีย 7AF ประมาณ 10% ในระยะเวลา 2 วัน Normal blood /-20 C / sodium fluoride 7AF ลดลง

ต่างกัน Robertson and Drummer Normal blood /-20 C / sodium fluoride Stability of 7AF ต่างกัน Robertson and Drummer Normal blood /-20 C / sodium fluoride 7AF ลดลง ตัวอย่างที่ศึกษาไม่เหมือนกัน เลือด กับ ปัสสาวะ จึงให้ผลที่ต่างกัน

ป้องกันการสลายตัวของ 7AF aseptic collection kit NaN3

Stability of COC and 6AM Fig. 7. Time-course changes in the concentration of COC and 6AM in the severely contaminated urine under various storage conditions ((●) with filtration, at 25 °C; (♦) with NaN3, at 25 °C; (■) without any preservative measures, at 25 °C; (○) with filtration, at 4 °C; ( ) with NaN3, at 4 °C; (□) without any preservative measures, at 4 °C).

Stability of COC and 6AM ปนเปื้อนรุนแรง/ no preservative /- 20˚C / 150 วัน / 7AF ไม่เปลี่ยน ปนเปื้อนรุนแรง/ no preservative / 4˚C/ 150 วัน/ COC และ 6AM ไม่เปลี่ยน ปนเปื้อนรุนแรง/ no preservative / 25˚C/ 30 วัน/ COC และ 6AM หายไป ปนเปื้อนเล็กน้อย/ no preservative / 25˚C/ 30 วัน/ COC และ 6AM หายไป ปนเปื้อนรุนแรง/ NaN3 / 25˚C/ 75 วัน/ ตรวจไม่พบ COC ปนเปื้อนรุนแรง/ NaN3 / 25˚C/ 75 วัน/ 6AM สูญเสียไป 75 %

Stability of COC and 6AM จากผลการทดลองพบว่า เมื่อกรอง ให้ผลดีในการรักษา COC และ 6AM แต่กลับพบว่าเมื่อใช้ กรอง + NaN3 กลับให้ได้ผลไม่ดี มีการสูญเสีย COC และ 6AM แสดงว่า NaN3 มีผลทำให้ สูญเสีย COC และ6AM

Stability of COC and 6AM COC and 6AM hydrolyzed เองหรือ/และ ด้วย enzymatically เปลี่ยน ฟอร์มเป็น benzoylecgonine methylecgonineและเปลี่ยนเป็น morphine การเกิด hydrolysis จะเกิดขั้นในสภาวะที่เป็นด่าง อัตราการ hydrolysis ในปัสสาวะที่ปนเปื้อนรุนแรงจะเร็วกว่าปัสสาวะที่ปนเปื้อนเล็กน้อยหลายเท่า เป็นไปได้สูงที่ว่าการเกิด hydrolysis ภายใต้สภาวะที่มี pH สูงทำให้bacteria แพร่พันธุ์

Stability of COC and 6AM NaN3 มีผลต่อการสลายตัวของยาเนื่องจาก azide anion functions เป็น a strong nucleophile จับกับ carbonyl carbon และเป็นไปทำให้เกิด hydrolysis ของ ester bond ในสภาวะเบสอ่อน

Stability of COC and 6AM , Fuller and Anderson: 12 weeks /20 C/ 0.1 wt% NaN3/ มีการลดลง 6AM ผลการทดสอบต่างมีความแตกกต่างกันเป็นไปได้เนื่องจากระยะเวลาในการศึกษาต่างกัน 90 กับ 150 วันและความเข้มข้น NaN3 ที่ใช้ในการทดสอบต่างกัน 0.1 wt% กับ 0.5 wt% ,

ชุดกรองเก็บปัสสาวะแทน NaN3 Stability of 6AM เพื่อป้องกันไม่ให้ปริมาณ 6AM สูญหาย ชุดกรองเก็บปัสสาวะแทน NaN3

สรุปและวิจารณ์ผลการทดลอง การใช้ Aseptic collection of urine specimens ในการกรอง สิ่งส่งตรวจประเภทปัสสาวะที่คณะผู้วิจัยได้คิดค้นขึ้นมามีประสิทธิภาพในการลดการสลายตัวยาในสิ่งส่งตรวจประเภทปัสสาวะได้ การใช้ Aseptic collection of urine specimens ในการกรองปัสสาวะเป็นวิธีที่ลดการปนเปื้อนของแบคทีเรียที่ดีกว่าการใช้ Sodium azide เป็นสารกันบูดในปัสสาวะ

ความคิดเห็นที่มีต่องานวิจัย การเก็บตัวอย่างที่อุณหภูมิ -20 และ 4 องศาเซสเซียสเป็นอุณหภูมิที่เหมาะสมที่สุดตามลำดับ ตัวอย่างมีข้อจำกัดต้องอยู่ที่ 25 องศาเซสเซียสจะต้องมีการกรองหรือและใช้ NaN3 เพื่อยั้บยั้งการสลายตัวของสาร งานวิจัยนี้สามารถนำไปประกอบเป็นข้อมูลของคู่มือการส่งตรวจทางนิติเวชได้ อาจจะพัฒนาไปสู่การผลิตชุดกรองที่มีสารเคมีที่เหมาะสมในการยับยั้งการสลายตัวของยาโดยไม่รบกวนตัวยา ศึกษาว่าควรใช้ภาชนะใดที่สามารถเก็บรักษาปัสสาวะ โดยที่สารไม่ถูก Adsorption โดยพื้นผิวของภาชนะ ศึกษาในความคงตัวของยาในตัวอย่างอื่นๆ เช่น ผม เล็บ

จบการนำเสนอ ขอบคุณค่ะ