Increase infective propagules for Inoculation,Taxonomy, etc. Culture of Pathogens Increase infective propagules for Inoculation,Taxonomy, etc. Vegetative/Asexual/Sexual 1. quality (sporulation) 2. quantity (repeated transfers)

Factors affecting cultivation Culture Media ( Major factor ) อาหารที่ดีควรส่งเสริมการสร้างสปอร์ ลดการสร้างเส้นใย ความเข้มข้นของอาหารมีผลต่อคุณภาพของสปอร์และเส้นใย environmental condition Aeration , Light and Dark, RH , Temp. , etc)

Nitrogen Vitamins Carbon Ammonium Arginine Asparagine Nitrate Urea Lysine Eystine glycine Vitamins Biotin Inosital Pyridoxine Riboflavin Thiamine Carbon Arabinose Calcium Cellulose Fructose Fucaric acid Galactose Glucose Moltose Mannose Mannitol Ribose Sucrose Sorbital Starch Xylose

วิธีเตรียม Natural media Syn.( natural media ) - plant parts - Susceptible plant Low conc . Medium ( low C and / or N ) Nutritional exhaustion Sporulation วิธีเตรียม Natural media ต้ม , extracts juices , powder agar ( spore) chopped leaves , stem , root ,ผล , ฟาง ( fructification ) gas sterillized + 1.5 % water agar , ทราย ( moist chamber ) inoculation ( No universal synthetic media for sporulation ) ต้องทดสอบ

ปัจจัยหลักที่เกี่ยวข้อง Temperature มีผลต่อการสร้างสปอร์ และเส้นใย ช่วงอุณหภูมิเหมาะสม - Sporulation แคบกว่า Vegetative growth - Constant or fluctuation ปัจจัยหลักที่เกี่ยวข้อง Species/Isolates

Light ปัจจัยหลัก อาหารและอุณหภูมิ ซึ่งแปรตาม ชนิดของแสง ความเข้ม และระยะเวลาที่ให้ มีผลกระตุ้นทั้ง asexual และ sexual Ultraviolet ( UV ) near UV ( NUV ) Red light dark / light

Light conidiophore formation and sporogenesis (initiate) Light conidiophore formation and sporogenesis Alternaria , Choanephora , Helminthosporium , Peronospora Stemphylium (light sporulation )

Light ( inducing sporulation ) General recommendation Black light fluorescent NUV 320 – 420 nm. กรณีใช้ 40 w วาง ขนาน 20 cm. สูงจากจาน 40 cm. Timer 12/12 : dark / light อายุเชื้อที่จะใช้ 2 -3 วัน ภาชนะที่ใช้ต้องให้แสงผ่านได้ เชื้อราส่วนใหญ่ชอบ day tem. 21 -24 OC

pH เชื้อรา เจริญได้ดีในอาหารที่ค่อนข้างเป็นกรด pH 5.5 - 6.0

Inoculation Inoculum Techniques Establishment of diseases การเตรียม การตรวจสอบ ปัจจัยที่เกี่ยวข้อง

Objectives Pathogenicity testing Evaluation of cultivars , line or selection for diseases resistance Diagnosis Chemical testing host – parasite interaction etc.

หลักการการปลูกเชื้อ 1. Pure culture 2. Virulence ( quality ) 3. Optimum conc. ( quantity ) 4. Suitable method 5. Optimum condition ทั้งก่อนและหลังปลูกเชื้อ 6. Susceptible stage of host - อายุ (age ) - Physiological age - stress

3. Media (infectivity potential) ข้อควรคำนึงถึง ในการปลูกเชื้อ Additives : - Polypeptone : Furarium - sucrose : Botrytis cinerea - Asparagine, Glucose : Phoma - Molasses - Potato dextrose : Fungi : 1. Spore viability 2. Age of culture 3. Media (infectivity potential)

Inoculum : การเตรียม , การตรวจสอบ , วัดปริมาณ Fungi Bacteria Nematode Virus Viroid Mollicutes

Haemacytometer www.superior.de www.poly-optik.de

E พื้นที่บริเวณ E เท่ากับ 25 x 16 x 1/400 ตารางมิลลิเมตร ปริมาตร(ลึก 1/10 มิลลิเมตร) จะเท่ากับ 25 x 16 x 1/400 x 1/10 ลูกบาศก์มิลลิเมตร หรือ 0.1 ลบ.มม สมมุตินับสปอร์ในบริเวณ E ได้รวมทั้งหมดเท่ากับ Y สปอร์ ใน 0.1 ลบ.มม ต้องการเทียบความเข้มข้นในหน่วย 1 ลบ.ซม หรือ 1 มล. ซึ่ง 1 มล. เท่ากับ 1000 ลบ.มม ดังนั้น ในปริมาตร 0.1 ลบ.มม นับสปอร์ได้เท่ากับ Y สปอร์ ถ้าใน 1000 ลบ.มม (1 มล.) จะมีสปอร์เท่ากับ Y x 1000 x 1/0.1 สปอร์ = Y x 1 x 104 สปอร์/มล.

Root Inoculation ราด คลุก 1. การปลูกเชื้อลงไปในดิน variation 1. การปลูกเชื้อลงไปในดิน Non-sterilized soil / sterilized soil disease reaction Pytheaceous กล้างอกแล้ว Damping off ปลูกหลังคลุก 2. Hydroponic method - Hoagland , s solution ( low conc ) - vascular wilt , root rot zoospore variation Soil microbial Moist , tem., chemical Soil type , agro – climatic Interaction Stimulate inhibit neutral

Root Inoculation ( ต่อ ) Root Dip : ต้นกล้า จุ่มใน spore suspension 1 -24 *hr. (ล้าง / ไม่ล้าง ) ปลูกใน sterile sand , mixed Cut and Dip : - ตัดรากใน spore suspension - bacterial wilt ตัดปลายราก ~ 1 cm จุ่มนาน 10 – 60 วินาที ( 2 -4 ml.of inocu ) 5. Root stabbing : ~ ดินที่สามารถอุ้ม + เก็บ inocu .( ควรรดน้ำก่อนทดลอง 2 วัน )

Root Inoculation ( ต่อ ) กรณีรากมีขนาดใหญ่ เจาะรูขนาด 1-2 ซม. ใส่ agar culture disk ปิดแผลด้วย foam In vitro methods : ใช้กับพืชขนาดเล็ก , autoclave soil เช่น แช่เมล็ดใน cone . Inoculum 1 – 24 hr. แล้วนำไปเพาะในทราย , WA ( root rot ) ส่วนใหญ่ใช้เพื่อตรวจดู seedling susceptibility

Stem inoculation Screening for vascular wilt resistance canker , crown rot , damping off , root rot , stalk rot มีการทำแผล (wound) ; root pathogen stem ทำแผล สูง 2 – 10 ซม. จากผิวดิน ( ทั่วไปทำแผลยาว 1 – 1.5 ซม.) เมื่อใส่ เชื้อลงไปในแผลแล้ว ปิดแผล ( ควรใส่เชื้อหลังทำแผลทันที ) Wilt pathogen : ใช้ไม้จิ้มฟัน , เข็ม แทงเหนือซอกใบ + หยด inocu . suspension , กรณี bacteria ให้หยด ก่อนแทง ( แผลสด ) - เข็มฉีด (injection) ( ระวังพืช shock ) Puccinia graminis leaf sheaths

Leaf inoculation (spray, brush, rubbed, dip) ส่วนใหญ่ไม่ต้องทำแผล blight spot pustules vein necrosis เชื้อเข้าทำลายทาง stomata epidermal cell junction Spore suspension อาจเตรียมโดยใช้ น้ำ , น้ำมัน (ยกเว้นกรณีราแป้ง) หรืออาจเติม surfactant (สารจับใบ) Tween 20,80,sodium oleate 0.05 % หรือ 0.1 % soft soap (ควรทดสอบ การงอกของ spore ก่อนทดลองใช้จริง) Adhesive agents : 0.5 % gelatin , 0.1 -0.2 agar , carboxyl – methyl cellulose (ป้องกันไม่ให้สปอร์แห้ง + มีสารอาหารเพื่อให้สปอร์งอกได้)

Seed inoculation ( pathogenisity test , resistance cultivars ) soilborne pathogen , damping off , foot rot , root rot systemic infection : - downy mildew , smuts (cone. young mycelial ) Spore > mycelial seed coating เพาะในทราย , vermiculite ที่อมฆ่าเชื้อ ( อาจใช้ moisted filter paper ) Ex. Fusarium ( wheat ) : - seed ( ฆ่าเชื้อที่ผิว ล้างน้ำ ) (เขย่าเบา ๆ บ่อย ๆ ) แช่ใน spore susp . 24 ชม.

Seed inoculation (ต่อ) ราน้ำค้างใช้ oospores > conidia anthracnose resistance ในถั่ว, ถั่วเหลือง downy mildew ของข้าวโพด, ถั่วเหลือง smut ของข้าว ใช้เมล็ดที่งอกมาปลูกเชื้อ

Bacterrial inoculatio ( spray 2.5 – 3.0 kg/cm 2 ระยะห่าง 3-6 ซม. จากใบ ) lower lea : - low pessure spraying , rubbing , soaking moist chamber 3 – 4 ชม . ก่อน inoc . inoc . 24 ชม. inoculum > 5 *106 อาจผสมผง carborundum ( 300 -600 mesh ) การติดใบ ( X. Campestris ) spary หรือ dip การทำแผลด้วยปลายแหลม : die – back , ใบจุด , soft rot ,wilt injection : - leaf and stalk rot เหมาะกับพืชใบอวบ กรณีเม็ดใช้วิธีแช่ + vacuum 1 – 5 min ปลูก กรณีใช้เมล็ดจำนวนมาก flooding

Detached plant parts inoculation removed + alive symptoms develop ประหยัด แรงงาน พืช สถานที่ inoculum ง่ายต่อการการจัดการ ส.ว. ล ส่วนใหญ่ใช้กับส่วนใบโดยเฉพาะเชื้อพวก obligate par . ไม่ใช้ใบแก่ เก็บใบตอนบ่อยดี ( protein + carbohy . สูง) ข้อระวัง : - susceptibility ~ อายุใบ H2O ลอยใน solution solution + hormone - ใช้ทั้งใบ , leaf disk ล้าง - moist chamber + น้ำตาล ฯลฯ - กระดาษชื้น ใบที่เน่าง่าย เช่น ใบมันฝรั่ง – มะเขือเทศ ควรบ่มเชื้อให้ไม่โดนน้ำโดยตรง อาจมีการทำแผลในการปลูกเชื้อบางเชื้อ

การเก็บรักษาเชื้อ วิธีการ ~ ชนิดของเชื้อ Culture purity สิ่งที่ต้องรู้ ก่อนเก็บ morphology , growth characteristics pathogenic behavior อาจเกิดการเปลี่ยนแปลงระหว่างเก็บ Periodic transfer : ย้ายเชื้อลงเลี้ยงในอาหารใหม่เป็นช่วง ๆ - adapted saprophytic growth lose pathogenicity or fail to sporulate - ระยะเวลาการเปลี่ยนอาหารแปรตาม อุณหภูมิ และ ความชื้น Ex. เก็บใน test tube + RH + t 5 - 8 . C เก็บนาน 6 เดือน หากเก็บในเมล็ดพืชแทนอาหารสังเคราะห์ เก็บนานขึ้น

ข้อควรคำนึงถึงในการเก็บรักษาเชื้อรา 1. Rich สลับ poor media (เลี้ยงใน C ต่ำ, pH เป็นกลาง) 2. Mycelial growth ต่ำ Sporulation สูง 3. Transfer โดยใช้ spore , young colony 4. ระบายอากาศดี , อย่าปิดฝาแน่นเกินไป 5. เก็บ ที่ t 4 – 10 OC (หลัง colony ขึ้นเต็ม แล้ว) (อาจใช้ไม่ได้กับเชื้อที่อ่อนแอต่ออุณหภูมิต่ำ)

Drying infected tissue or agar culture plant press เก็บที่ RH + t ต่ำ desiccant ( Sporulation ) Ex1. 1. เลี้ยงเชื้อบน PDA, Zapek , เมล็ดข้าว (autoclave) 2.เมื่อเชื้อเจริญ ย้ายเชื้อไปไว้บน blotter paper (desiccators) 3. Sealed container แล้วนำไปเก็บในตู้เย็น หรือที่ Rt+ RH

เก็บในน้ำ (H2O , 0.85 % NaCl in H2O) Ex.2 PDA (filter paper) pathogen desiccants (CaCl2 , Silica gel) ตู้เย็น เก็บในภาชนะปิด เก็บในน้ำ (H2O , 0.85 % NaCl in H2O) Culture disks Bacterial cell เก็บในตู้เย็นหรือที่ Rt.

Obligate parasite ส่วนใหญ่นิยมเก็บใน susceptible host เช่น 1. Erysiphe graminis ปลูกเชื้อลงบน barley seedling บ่มเชื้อที่12 OC (sporulation) / transfer 4 – 6 w . ต่อครั้ง 2. Rust : เลี้ยงบน detached wheat leave โดยจุ่มรอยตัดใน 10% sucrose เมื่อ spore งอก เก็บแห้งใน silica gel (0- 5 OC )

เก็บใน Mineral Oil เลี้ยงเชื้อบน agar media ให้เจริญคลุม แล้วเท Mineral Oil ทับผิวหน้า (เชื้อราอาจเจริญต่อได้แต่อย่างช้าๆ แต่ไม่ควรใช้กับเชื้อที่สร้างกรด) (Aseptic condition ) Sterile mineral oil, suitable agar medium slant and sporulated เมื่อต้องการเลี้ยงนำเชื้อไปstreak plate 2-3 หน (หรือใช้น้ำล้างOilออก) (หากเชื้อเป็น oil sensitive หรือกระทบการเจริญต้องเลือกเก็บวิธีอื่น)

แช่แข็ง (Freezing) 1. Deep freeze (-20 o C) ( - 80 o C) 2. Cryogenic ultra low temperature ( -100. o C) 3. Ultra-rapid freezing (-180 – -196 o C) Ex : Erwinia, Pseudomonas., Xanthomonas เก็บได้นาน 18 เดือน โดยแช่แข็งที่ (-20 oC) เก็บได้นาน 2-3 ปี โดยแช่แข็งที่ (-70 oC)

Preservation in liquid nitrogen (- 196 oC) non mutagenic and not influence morphology and pathogenicity Fungi : spore or mycelium + DMSO (dimethyl sulfoxide : cryoprotectant) obligates parasites: susceptible host เก็บใน tissue/แยก spore survival rate - freezing procedure - thawing rate

Lyophilization and Vacuum drying หลักการ : ลดปริมาณน้ำของเชื้อ ให้เหลือ 2 – 3 % แล้วนำไปเก็บในที่ไม่มีออกซิเจน (Dry state : cell จะอยู่ในสภาพพักตัว (dormant) metabolic activity ต่ำ ทำให้สามารถเก็บเชื้อได้นาน 17 -24 ปี ทั้งนี้ขึ้นกับชนิดของเชื้อ) ขั้นตอน 1. prefreez 2. vacuum arying at frozen + lowtem. 3. vac ต่อ ที่ rt. 4. sealing

Lyophil tube 5 cm. Cotton plug Desiccant (P2O5 , CaCl2 , MgClO, Silica) 7.5 cm. Second seal 6 cm. Culture ( 0.1 ml, 3 – 5 mg. of spores ) 30 cm.

วิธีการเก็บเชื้อที่นิยม เก็บในดิน Fusarium Actinomycotina Rhizoctonia Corynebacterium Drying Drechslera Cochliobolus Sclerotinia Glomerella Septoria Penicillium Streptomyces

How to Collect Specimens

Important Collect good-quality, accurate information about the host plant and location where the collection was made. Determine the identity of the host plant If you are uncertain of the host plant it is advisable to collect healthy material for a botanist

Collecting Equipments Envelopes literature Plastic bag Hand lens Machete Scissors Handsaw Maps Ink markers Gps Newspaper Trowel Ice box Paper bag Plant press labels Pencil

Handling Specimens Use paper bags for specimens NEVER wrap fresh herbaceous plant in plastic PLASTIC bag should only be used for short term storage of damp specimens Press specimens flat between sheets of paper

Leaves Leaves should be collected when they are dry. Press and dry laves between layers of newspaper making sure to spread the leaves out so they do not overlap. It may be necessary to change the newspaper daily until the leaves dry out.

Stems and Fruit Section of stems collected should have both healthy and diseased areas of tissue Carefully wrap the samples individually in newspaper as they can be easily damaged if they are packaged together Wrap fruit separately in dry newspaper

Roots Do not pull plant from the soil as this may shear diseased tissue or pathogens away. Shake off excess soil or if possible wash the roots gently (unless testing for nematodes). Wrap the roots in newspaper for transport back to laboratory.

Soil Soil samples should be taken at least 5-10 cm. below the surface. Individual soil samples should weigh approximately 250-300 g. Soil samples should be placed in strong plastic bags with a pencil-written paper or plastic label.

Get Permission to Collect Obtain the necessary permits for collection and movement of the specimens. The collection of specimens may restricted in some areas, for example in national parks or on private land.

Labeling Specimens Record the following details Name of pathogen (if know). Name of host plant and plant part affected Precise location, town, province, country. Collection date. Collector’s name and collection number. Diseases symptoms and severity.

Recording Locality Information The location is the second most important element of the plant disease record after the pathogen identify. Be precise, “Kaewalin’s garden” may be meaningful to the collector, but not to others. List the nearest town if you’re collecting from a plantation, forest, roadside, etc.

Collection Slips

Submitting Specimens A specimen is proof of occurrence Lodging specimens in herbaria is important as it allows pathologists to map the distribution of plant diseases and document their spread over time.

How to Recognise Plant Diseases What are symptoms Common symptoms What are signs Common signs