การตรวจการติดเชื้อไวรัสเวสต์ไนล์ ในประเทศไทย สุมาลี ชะนะมา sumalee.c@dmsc.mail.go.th สถาบันวิจัยวิทยาศาสตร์สาธารณสุข

หัวข้อบรรยาย บทนำ การตรวจสารพันธุกรรมวิธี RT-PCR การตรวจสารพันธุกรรมวิธี Real-time RT-PCR การตรวจแอนติบอดีวิธี ELISA และ IIFT สรุป

บทนำ West Nile virus Family Flaviviridae, Genus Flavivirus Vector: Culex mosquitoes อาการเล็กน้อย มีไข้ ปวดศีรษะ ปวดตามร่างกาย อาจมีผื่นแดงที่ผิวหนัง ต่อมน้ำเหลืองโต อาการรุนแรง เยื่อหุ้มสมองอักเสบ สมองอักเสบ คอแข็ง มือสั่น ชัก กล้ามเนื้ออ่อนแรง เป็นอัมพาต ซึม สับสน หมดสติ อาการรุนแรงมาก เสียชีวิต ไม่มีวัคซีน

การตรวจสารพันธุกรรมวิธี RT-PCR เริ่มพัฒนาวิธีพ.ศ. 2550 อ้างอิง NIID, Japan ไพรเมอร์ 2 ชุดจำเพาะกับไวรัสเวสต์ไนล์ ส่วน Envelope (E) และส่วน Nonstructural 3 (NS3) Primer Sequence Product size WNNY514 CGG CGC CTT CAT ACA CW 408 bp (E) WNNY904 GCC TTT GAA CAG ACG CCA TA Fla-U5004 GGA ACD TCM GGH TCN CCH AT 471 bp (NS3) Fla-U5457 GTG AAR TGD GCY TCR TCC AT

การตรวจสารพันธุกรรมวิธี RT-PCR Reagent Volume 2xOne-step RT-PCR buffer 12.5 µl 10 µM WNV primers / Fla primers 1.0 µl 10 µM BA-1 primer 0.2 µl 10 µM BA-4 primer RNase inhibitor SuperScript III/RT/Taq Mix RNase free DW 4.9 µl RNA sample 5.0 µl

การตรวจสารพันธุกรรมวิธี RT-PCR cDNA synthesis: 50oC 30 min Denaturation: 94oC 2 min Amplification: 94oC 30 sec, 53oC 30 sec, 72oC 30 sec  40 cycles Extension: 72oC 5 min

การตรวจสารพันธุกรรมวิธี RT-PCR E 408 bp NS3 471 bp

การตรวจสารพันธุกรรมวิธี RT-PCR E 408 bp NS3 471 bp

การตรวจสารพันธุกรรมวิธี RT-PCR รวมจำนวนตรวจ เมษายน 2550 ถึง มิถุนายน 2553 245 ตัวอย่าง CSF 47 ตัวอย่าง Serum 198 ตัวอย่าง ผลตรวจ E region พบ weakly positive 4 ตัวอย่าง ผลตรวจ NS3 region พบ weakly positive 1 ตัวอย่าง ไม่สามารถตรวจยืนยันได้ว่าเป็น WNV infection จริงเนื่องจากตัวอย่างไม่พอส่งตรวจเพิ่ม

การตรวจสารพันธุกรรมวิธี Real-time RT-PCR เริ่มพัฒนาวิธีพ.ศ. 2553 อ้างอิง J Virol Method 2005(126), 119-125

การตรวจสารพันธุกรรมวิธี Real-time RT-PCR หลักการ TaqMan RT-PCR (5’Nuclease assay) TaqMan MGB probe MultiScribe Reverse transcriptase (recombinant Moloney Murine Leukemia Virus, MuLV, RT) AmpliTaq Gold DNA polymerase: 5’ to 3’ Nuclease activity ROX normalization correct well-to-well fluorescent fluctuations Primer/Probe Sequence Product size WNV-F GCA CGA AGA TCT CGA TGT CTA AG 75 bp WNV-R ATT CCG CGT TTT AGC ATA TTG AC WN-JE probe ACC AGG AGG GCC CGG (FAM-MGB)

TaqMan probe Hydrolysis probe Dual-labeled target-specific fluorescent probe Nucleotides contain a fluorescent dye on 5’ end and quenching dye on 3’ end

Commonly used combinations of reporters and quenchers Compatible Quencher FAM BHQ1, TAMRA TET BHQ1 HEX BHQ1, BHQ2 TAMRA BHQ2 Texas Red BHQ2, BHQ3 ROX Cy5

TaqMan MGB probes 5’ reporter dye 3’ non-fluorescent quencher (NFQ) = MGB (Minor groove binder) Lower background signal Better precision in quantitation Higher Tm, increased specificity Can be shorter than traditional dual-labeled probe FAM, VIC, TET, NED

TaqMan MGB probes

Dye sets for ABI 7500 520 nm 550 nm 580 nm 610 nm 650 nm FAM JOE TAMRA ROX CY5 SYBR Green VIC NED TEXAS RED TET CY3

cDNA synthesis 48oC 30 min Denature 95oC 10 min Amplification 95oC 15 sec, 60oC 60 sec for 42 cycles Data collection

การตรวจสารพันธุกรรมวิธี Real-time RT-PCR Reagent Volume 2x Master Mix 12.5 µl 40x MultiScribe enzyme 0.625 µl 20 µM WNV-F primer 1.125 µl 20 µM WNV-R primer 10 µM WN_JE probe (FAM-MGB) RNase free DW 6.0 µl RNA sample 3.0 µl Target gene: Capsid region

การตรวจสารพันธุกรรมวิธี Real-time RT-PCR ABI 7500 Real-time PCR machine cDNA synthesis: 48oC 30 min Denaturation: 95oC 10 min Amplification: 95oC 15 sec, 60oC 60 sec 43 cycles Data collection at extension step (60oC 60 sec) ROX normalization

การตรวจสารพันธุกรรมวิธี Real-time RT-PCR Standard curve: slope -3.6 ถึง -3.3 efficiency 90-100% R2 > 0.980 Slope -3.489 R2 0.999

การตรวจสารพันธุกรรมวิธี Real-time RT-PCR เกณฑ์ตัดสินผลบวก Clear amplification curve CT < 40.0 delta RN > 0.5 เกณฑ์ตัดสินผลลบ no amplification curve CT > 40.0 delta RN < 0.5

การตรวจสารพันธุกรรมวิธี Real-time RT-PCR รวมจำนวนตรวจ สิงหาคม 2553 ถึง พฤษภาคม 2555 601 ตัวอย่าง CSF 321 ตัวอย่าง Serum 280 ตัวอย่าง ผลตรวจเป็น Negative ทั้งหมด

การตรวจแอนติบอดี West Nile Virus IgM Capture ELISA (E-WNV02M) West Nile Virus IgG Indirect ELISA (E-WNV01G) Panbio

การตรวจแอนติบอดี Most patients have detectable levels of IgM antibodies 7-8 days after the onset of symptoms. IgM antibody has been shown to persist for >500 days in approximately 60% of cases. Most patients exhibit IgG antibodies 3-4 weeks post infection.

การตรวจแอนติบอดี พ.ศ. 2550-2552 ตรวจ 300 ตัวอย่าง ผลบวก WN IgM 74 ตัวอย่าง ผลบวก WN IgG 84 ตัวอย่าง ผลบวก JE IgM 234 ตัวอย่าง ผลบวก DEN IgM 125 ตัวอย่าง ไม่มีตัวอย่างที่ให้ผลบวกเฉพาะ WN IgM/IgG เท่านั้น มี cross reactive กับ Japanese encephalitis virus และ Dengue viruses

การตรวจแอนติบอดี ส่งตัวอย่างตรวจวิธี ELISA ที่ Research Center for Emerging Viral Diseases (RCEVD) มหาวิทยาลัยมหิดล จำนวน 3 ตัวอย่าง พบว่ามี cross react กับ JEV และ WN antigen ไม่สามารถระบุเชื้อสาเหตุของโรคได้ แนะนำให้ตรวจด้วยวิธี Neutralization antibody test

การตรวจแอนติบอดี 3. วิธี Indirect immuno-fluorescence test (IIFT)

การตรวจแอนติบอดี 3. วิธี Indirect immuno-fluorescence test (IIFT, EUROIMMUN) IgM และ IgG ตรวจ 44 ตัวอย่าง ผลบวก IgG 20 ตัวอย่าง (+Den IgM/IgG 2 ตย) ผลบวก IgM 1 ตัวอย่าง (JEV infection) มี cross reactive กับ JEV และ Dengue viruses

สรุป ฝ่ายอาโบไวรัสตรวจสารพันธุกรรมไวรัสเวสต์ไนล์ ช่วงพ.ศ.2550-2555 ทั้งหมด 846 ตัวอย่าง เป็น CSF 368 ตัวอย่าง serum 478 ตัวอย่าง ตรวจด้วยวิธี RT-PCR 245 ตัวอย่าง ตรวจด้วยวิธี Real-time RT-PCR 601 ตัวอย่าง ผลตรวจสารพันธุกรรมไม่พบการติดเชื้อไวรัสเวสต์ไนล์ ผลตรวจแอนติบอดีวิธี ELISA และ IIFT พบผลลบปลอมจากการติดเชื้ออาโบไวรัสอื่นๆเช่น ไวรัสเดงกี ไวรัสเจอี

ขอบคุณ Dr. Ichiro Kurane Dr. Jean Paul Gonzalez นางสุรภี อนันตปรีชา นางวลัยลักษณ์ สุขประเสริฐ

ขอบคุณค่ะ