Amino acid & protein chemistry and structure ; อ. เนตรนภิส เป็นหน่วยย่อยที่เล็กที่สุดของโปรตีน สูตรโครงสร้างโดยทั่วไป AÂ แต่ละชนิด จะต่างกันที่ R-gr. AÂ ที่เป็นส่วนประกอบของโปรตีน ที่พบในสิ่งมีชีวิต จะเป็น L--amino acid AÂ แบ่งเป็น standard และ nonstandard AÂ Standard AÂ ; เป็นส่วนประกอบของโปรตีนในสิ่งมีชีวิต ; มี ~ 20 ชนิด แบ่งออกเป็น 2 กลุ่ม คือ essential AÂ กับ nonessential AÂ

Essential AÂ His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Thr, Trp, Val Nonessential AÂ Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, Pro, Ser, Tyr Nonstandard AÂ (AÂ derivatives) เปลี่ยนแปลงมาจาก AÂ ชนิดใดชนิดหนึ่งใน 20 ชนิด อาจพบเป็นส่วนประกอบของโปรตีนหรือไม่ก็ได้ หรือ เป็น intermediates ใน metabolism หลายๆอย่าง เช่น 4-OH Proline, 5-OH Lysine, selenocysteine, ornithine, citrulline

การเรียกชื่อย่อของ AA Three-letter abbreviation One-letter abbreviation Alanine = Ala = A Arginine = Arg = R Isoleucine = Ile = I Classes of AA แบ่งตาม คุณสมบัติ ของ R-gr. ที่ phys. pH ; AÂ with 1) Nonpolar, aliphatic R-gr. 2) Aromatic R-gr. 3) Polar, uncharged R-gr. 4) (-)-charged R-gr. (Acidic AÂ) 5) (+)-charged R-gr. (Basic AÂ)

1) Nonpolar aliphatic R-gr. R-gr. ; nonpolar ไม่ form H-bond/ionic bond ; hydrophobic e.g Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Met

2) Aromatic R-gr. 3) Polar, uncharged R-gr. R-gr. ; Hydrophilic (their functional gr. can form H-bond with H2O) R-gr. ; Aromatic side chains & hydrophobic

4) Negatively charged (acidic) R-gr. 5) Positively charged (Basic) R-gr. R-gr. เป็น acid (H+ donor) มีประจุ – ที่ phys. pH e. g Asp, Glu R-gr. เป็น base (H+ acceptor) มี ประจุ + ที่ phys. pH

Properties of AÂ 1) Acid-base properties 2) UV absorption 1) Acid-base properties AÂ in aqueous sol. จะแตกตัว หมู่ที่แตกตัวให้ประจุ NH2, COOH และ R-gr. ประจุสุทธิ (net charge) +/- เมื่อ AÂ ละลายน้ำ ที่ physiological pH (~7.4) จะอยู่ ในรูป dipolar ion (Zwitterion)

COO- Zwitterion NH3+ C H R Zwitterion จะทำตัวเป็นกรด (H+ donor) หรือเบส (H+ acceptor) ก็ได้ สารที่มีคุณสมบัติเป็นได้ทั้ง acid กับ base amphoteric หรือ ampholytes

COOH COO- การแตกตัวของ AÂ ในน้ำ NH3+ C H NH3+ C H R R COO- NH2 C H R pK1 pH=pI ; N.C = 0 pH<pI ; N.C + pK2 pH>pI ; N.C - pI = Isoelectric point

Titration curve of Glycine pI = Isoelectric point pH ที่ทำให้ AÂ มี net charge = 0 AÂ หยุดการเคลื่อนที่ในสนามไฟฟ้ากระแสตรง ละลายได้น้อยที่สุด ; ตกตะกอน Titration curve of Glycine No ionisable R-gr. pI = (pK1 + pK2) 2 = 9.6 + 2.34 = 5.97

จากการที่ AÂ แตกตัวได้ COO- weak acid NH3+ weak base R-gr. weak acid/weak base AÂ จึงมีคุณสมบัติเป็น buffer (buffering capacity) His เป็น AÂ ที่มี buffering capacityดีที่สุดที่ phys. pH R-gr. แตกตัวได้ที่ physiological pH Imidazole ring pKR = 6 +

2) Absorbance of UV light AÂ can not absorb visible light Only Phe, Tyr, Trp absorb UV light at 280 nm Optical density (O.D280) measurement Tryptophan Tyrosine

PROTEIN CHEMISTRY AND STRUCTURE Peptide & protein Peptide เกิดจาก AÂ ตั้งแต่ 2 ตัวขึ้นไปมาต่อกันด้วย peptide bond ; 2 ตัวต่อกัน Dipeptide 3 Tripeptide 3-10 Oligopeptide 10-100 Polypeptide >100 Protein

Peptide bond formation NH2-terminus COOH-terminus Peptide bond

หน้าที่ของ peptide 1) ขยายหลอดเลือด ความดันโลหิต e.g bradykinin 2) เป็นฮอร์โมน e.g oxytocin กระตุ้นการหดตัวของกล้ามเนื้อ 3) เป็น neurotransmitter e.g endorphine 4) เป็น antibiotics e.g penicillin (Penicillium spp.) 5) ช่วยกำจัด free radicals ซึ่งทำให้เกิดภาวะ oxidative stress e.g glutathione ; key antioxidant Protein เป็น polypeptide ที่มี MW > 10,000 dalton มีรูปร่าง (conformation) ต่างๆกัน ขึ้นอยู่กับการขดตัว ของ AÂ ที่เป็นส่วนประกอบของโปรตีนนั้นๆ

Function of proteins Structure โครงสร้าง เช่น collagen, -keratin (hair) Transport ขนส่งสารต่างๆไปยังส่วนต่างๆของร่างกาย หรือขนส่งสาร ต่างๆ ผ่านเยื่อหุ้มเซลล์ (cell membranes) เช่น Hb ; ขนส่ง O2 จากปอดไปยังส่วนต่างๆของร่างกาย Storage แหล่งสะสม ; myoglobin เป็นโปรตีนที่ทำหน้าที่สะสม O2 ในกล้ามเนื้อขณะที่ออกกำลังกาย ทำให้กล้ามเนื้อไม่ ขาด O2 Hormones ฮอร์โมน = chemical messengers ระหว่างเซลล์ต่างๆ ทั่วร่างกาย ฮอร์โมนบางอย่างเป็น peptide หรือ protein ; insulin

Membrane proteins โปรตีนที่เยื่อหุ้มเซลล์ ทำหน้าที่เป็น antigen ; blood gr. A, B, O ion channels ; ลำเลียง Na+, K+, etc. เข้า-ออกเซลล์ water channel ; aquaporins ลำเลียงน้ำ transporters ; GluT1 (glucose transporter 1) ลำเลียง glucose เข้า erythrocytes receptor ; โปรตีนบางอย่างทำหน้าที่เป็น receptor จับกับ neurotransmitter, peptide hormones ทำให้สารนั้นผ่านเข้าไปทำหน้าที่ภายในเซลล์ได้ (Biosignalling) Catalysis catalyse ปฏิกิริยาเคมีต่างๆในร่างกาย เช่น enzymes

Protein structure โปรตีนจะประกอบด้วย polypeptide 1 สาย หรือ >1 สาย ก็ได้มารวมกัน เพื่อทำหน้าที่ต่างๆ โดยต้องมี folding ที่ ถูกต้อง Structure ของโปรตีน มี 4 ระดับ Primary structure Secondary structure Tertiary structure Quaternary structure Levels of structure in protein

Primary structure เป็นการเรียงลำดับของ AÂ (amino acid sequence) ใช้ศึกษาถึงความสัมพันธ์ระหว่างโปรตีนชนิดต่างๆในพืชและสัตว์

Secondary structure มีการม้วนพับ (folding) เป็นรูปแบบที่สม่ำเสมอ โครงสร้างแบบ secondary structure ได้แก่ α-helix β-pleated sheet β-turns

-helix เป็น polypeptide ที่มี ลักษณะเป็น rigid rodlike structure NH2-gr ของ AÂ ที่เป็น backbone ตัวที่ 1 สร้าง H-bond กับ COOH-gr ของ AÂ ที่เป็น backbone ตัวที่ 4 เรื่อยๆไป พบได้ทั้ง right-handed และ left-handed α-helix Right-handed α-helix จะพบในโปรตีนตามธรรมชาติทั่วๆไป

β-pleated sheet ประกอบด้วย β-strands (AÂ 5-6 residues) มารวมกัน ทำให้ backbone ของ polypeptide มีการเรียงตัวแบบ zigzag ทำให้เกิดโครงสร้างแบบ β-pleated sheet Antiparallel β-pleated sheet β-strands เรียงตัวแบบสวนทางกัน ; เสถียรกว่า Parallel β-pleated sheet β-strands เรียงตัวไปทางเดียวกัน

Parallel -pleated sheet Antiparallel -pleated sheet

เป็นโครงสร้างที่ทำให้สายของ polypeptide (β-strand) โค้งงอ (kink) ได้ β-turns เป็นโครงสร้างที่ทำให้สายของ polypeptide (β-strand) โค้งงอ (kink) ได้ Gly & Pro เป็น AÂ ที่มักจะพบในบริเวณนี้ ; Gly มีขนาดเล็ก, flexible ; ส่วน Pro มี imino N อยู่ในรูป cis configuration -turn Peptide bond

Tertiary structure โครงสร้างแบบ 3 มิติ (3D structure) ของสาย polypeptide ซึ่งประกอบด้วย 2o structure หลายๆส่วน มารวมกันเป็น native conformation ทำให้ more Stable และ function as active protein โครงสร้างแบบ tertiary structure ได้แก่ Fibrous structures และ Globular structures

Fibrous structures เป็นโครงสร้างที่พบใน fibrous proteins ให้ความแข็งแรง มักประกอบด้วย 2o structure แบบใดแบบหนึ่ง ตัวอย่างเช่น -Keratin ; hair, nails Fibroin ; silk Collagen ; connective tissues (tendons, bone matrix)

Globular structures พบใน globular proteins e.g enzymes Domain

Quaternary structure ประกอบด้วย polypeptide > 1 สาย (subunit/monomer) มาจับกันเพื่อทำหน้าที่ แต่ละ SU อาจมีโครงสร้างเหมือน/ต่างกันก็ได้ ตัวอย่าง ; Hemoglobin, allosteric enzyme

พันธะที่พบในโครงสร้างของโปรตีน Peptide bond 2) Disulfide bond (S-S) Intrachain : Interchain S-S bond Dithiothreitol/β-mercaptoethanol ; reducing agent Oxidation Cysteine Sulfhydryl gr. Disulfide Cysteine Reduction Cystine

พันธะที่พบในโครงสร้างของโปรตีน 3) H-bond เกิดระหว่าง H atom กับ O หรือ N atom ที่อยู่ใน polypeptide สาย เดียวกันหรือคนละสาย หรือเกิดระหว่างหมู่ที่มีขั้วของ side chain กับ H2O 4) Hydrophobic interaction - Main forces that stabilise the 3D-structure of protein - AÂ ที่มี R-gr. เป็น nonpolar, aliphatic หรือ aromatic ring จะละลายน้ำ ยากจับกันด้วย hydrophobic interaction

5) Electrostatic bond (salt bridges) Side chain ที่มีประจุ + กับ – ของ AÂ ที่อยู่ใกล้กัน จะจับ กันด้วย salt bridges Glu 21 - Arg 154 + 6) Van der Waals interaction Weakest bond เกิดระหว่างหมู่ของ R-gr ที่ไม่มีประจุของ AÂ

Weak interactions in proteins H-bond

Protein denaturation เป็นการทำลายสภาพธรรมชาติของโปรตีน (denaturation) แบบไม่ถาวร และ แบบถาวร ทำให้คุณสมบัติบางอย่างเสียไป เช่น การละลาย

Protein denaturation ปัจจัยที่ทำให้โปรตีน denature 1) Physical agents ; heat, UV light, pressure, X-ray, ultrasound 2) Chemical agent ; ethanol, (NH4)2SO4 3) Detergents ; sodium dodecyl sulfate (SDS) 4) Biological agents ; proteolytic enzyme

คุณสมบัติของโปรตีน 1) การละลาย 2) Buffering capacity 3) การตกตะกอน 4) การดูดกลืนแสง 5) การจับกับ ion หรือสารบางอย่าง 1) การละลาย โปรตีนละลายใน polar solvent (น้ำ) ได้ดี ขึ้นกับ -ความเข้มข้นของ ion ในสารละลาย ความเข้มข้นน้อย ; โปรตีนละลายดี (salting in) ความเข้มข้นมาก ; โปรตีนตกตะกอน (salting out) -pH ของสารละลาย โปรตีนละลายดีในสารละลายที่มี pH เป็นกรด/ด่าง ที่ pI ; โปรตีนตกตะกอน

โปรตีนมีคุณสมบัติ ~ AÂ NH2, COOH, R-gr. dissociate at certain pH 2) Buffering capacity โปรตีนมีคุณสมบัติ ~ AÂ NH2, COOH, R-gr. dissociate at certain pH (N.C +/-) จึงมีคุณสมบัติเป็น buffer (ให้/รับ H+) ได้ เช่น blood protein 3) การตกตะกอน ตกตะกอนแล้ว โปรตีนไม่เสียสภาพอย่างถาวร salting out serum IgG Saturated ammonium sulphate ตกตะกอนที่ pI เปลี่ยน pH ไปที่ pI ของโปรตีน ; โปรตีน

ใช้ กรด/chemical reagents ตกตะกอนแล้ว โปรตีนเสียสภาพอย่างถาวร (denatured protein) Heat coagulation ใช้ กรด/chemical reagents ; picric acid, trichloroacetic acid (TCA), tannic acid mercuric chloride

4) การดูดกลืนแสง โปรตีน Absorb UV light ; Phe, Tyr, Trp Absorbance ;O.D280 ใช้หาปริมาณโปรตีน [Prot] O.D280 5) การจับกับ ion หรือสารประกอบบางอย่าง enzyme บางชนิด ต้องจับกับ cofactor Glycoprotein CHO + protein Fetal fibronectin ; anchors the amniotic membranes the uterus wall