Gene Manipulation Gene Manipulation GManipulation.ppt

Gene Manipulation การจัดการหรือตัดแต่ง genetic materials โดยตัดต่อ ระหว่างโมเลกุล DNA จากแหล่งที่ต่างกัน ได้ DNA โมเลกุลใหม่เป็นโมเลกุลผสม เรียกว่า Recombinant DNA วิธีการทำหรือ methodology เรียกว่า Recombinant DNA technology หรือ Genetic engineering หรือ Gene cloning * Clone หมายถึง ประชากรของสิ่งที่เหมือน

หลักการทำ Gene Cloning 1. เลือก DNA โมเลกุลที่ต้องการ clone เรียกว่า Foreign DNA และเลือก DNA โมเลกุลที่นำหน้าที่เป็นพาหะ เรียกว่า Vector DNA แยกตัด foreign DNA และ ตัด vector DNA ด้วย enzyme ชนิดเดียวกัน Enzyme ที่ใช้เรียกว่า Restriction enzyme

หลักการทำ Gene Cloning (ต่อ) 2. เลือกท่อน (fragment) ของ cut foreign DNA ขนาดพอเหมาะที่จะ clone โดย วิธีแยกในสนามไฟฟ้า Electrophoresis ซึ่งจะให้แถบ (bands) ของ DNA ขนาดต่าง ๆ กัน แล้วตัดและแยกแถบที่ต้องการออกมาสกัดแยกให้ได้ DNA fragment ที่ต้องการ

หลักการทำ Gene Cloning (ต่อ) 3. Insert DNA fragment เข้าไปในโมเลกุลของ cut vector DNA ด้วย enzyme Ligase จะได้ DNA ผสมโมเลกุลใหม่ เรียกว่า Chimeric DNA หรือ Recombinant DNA 4. Introduce Recombinant DNA เข้าไปใน host cells ของ cloning vector โดยวิธี transformation หรือ วิธีอื่น ๆ host cells โดยทั่วไปใช้ E. coli และ yeast

Recombinant DNA First cloning Principle of cloning

6. ทำการตรวจเลือกหา (screening) host cells มี recombinant DNA หลักการทำ Gene Cloning (ต่อ) 5. Recombinant DNA ภายใน host จะแบ่งตัวเพิ่มจำนวนและถ่ายทอดไปพร้อมกับการแบ่งตัวเพิ่มจำนวนของhost ทำให้ได้ identical copies ของ recombinant DNA จำนวนมาก เรียกว่า Amplification 6. ทำการตรวจเลือกหา (screening) host cells มี recombinant DNA

Cloning Vectors 1. Plasmid 2. Bacteriophage 3. Cosmid 4. Phagemid 5. Artificial chromosome

1. Plasmid vectors Plamids เป็น extrachromosome ใน microorganisms โดยเฉพาะ bacteria เป็น double-stranded circular โมเลกุล ขนาด ~ 1 kb (1 kb = 1000 bp) ถึง 200 kb มี antibiotic-resistance genes ที่สามารถใช้เป็น markers สำหรับคัดเลือก cloning ที่ positive pBR322 เป็น plasmid ตัวแรกที่ใช้ใน cloning

1.1 pBR322 ขนาด 43. Kb มี Ampicillin resisteant gene และ Tetracyclin resistant gene มี restriction sites มากและง่ายต่อการใช้ทำ cloning เช่น EcoRI, PstI, BamHI มี Origin of replication นำเข้า bacteria โดย Transformation pBR322

Cloning in pBR322 Amplification

1.2 pUC8 Plasmid ที่ carry 2 markers 1. lacZ gene code ให้ b-galactosidase และ 2. Amplicillin resistant gene culture E.coli host ใน X-galactopyranoside (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactopyranoside)

1.3 Yeast episomal plasmids / YEps 2 um plasmid ขนาด 6 kb มี gene resist ต่อ inhibitors เช่น copper และ methotrexate ใช้ leu2 gene เป็น marker

Cloning in yeast

1.4 Ti plasmid Ti plasmid หรือ T-DNA ใน Agrobacterium tumefaciens ในดิน integrate เข้า plant chromosomal DNA produce callus หรือ cancer growth หรือ crown gall ในพืช

Plant clonimg using Ti plasmid

2. Bacteriophage vectors Double-stranded virus ที่บางระยะอยู่ในรูป Linear duplex ได้ ส่วนมากใช้ Bacteriophage Lambda(l) ขนาด ~ 50 kb ใน Linear duplex form ที่บริเวณปลายสุดทั้ง 2 ข้างของเส้นเป็นช่วง Single strand ขนาด 12 nucleotides เรียกว่า Cohesive ends หรือ COS sites Cos sites ทำ complementary ต่อกัน ให้ได้ circular duplex DNA ก่อน pack เข้า capsule กลายเป็น bacteriophage

2.1 Charon phage vector l มี genes ~ 50 % ที่ จำเป็นต่อ growth l package DNA ให้ เป็น circular form ได้ 78-105 % l vector รับ insert ได้ 12-25 % จึงเหมาสำหรับ clone eukaryote เช่น ทำ Genomic library

2.2 M13 vector single-stranded phage Rolling circle replication รับ insert ที่เป็น single-stranded version ของ cloned gene ระหว่าง 300-1000 bases ใช้ cloning เพื่อ sequence DNA

3. Cosmid vector Vector ที่ construct จากส่วนของ 1. Plasmid : drug-resistant marker, origin of replication และ restriction sites จึงมี replication ได้เหมือน plasmid 2. l phage : cos sites สำหรับ packaging cloned DNA ให้เป็น phage chromosome ใน in vtro

cosmid มีขนาด 4-6 kb cosmid สามารถรับ insert foreign DNA ได้ระหว่าง 35 - 50 kb เหมาะในการ clone gene ขนาดใหญ่ของ eulararyote Cosmid vector

4. Pagemid vectors Vector ที่ construct ให้มี characteristics คล้าย cosmid คือ มีทั้งของ phage และ plasmid มี multiple cloning site insert เข้าที่ lacZ gene มี origin of replication จาก single-stranded f1 คล้าย M13 ทำให้ package ได้ single-stranded phagemid DNA

Transcription vector / Bluescript vector / pBS มี Multiple cloning site มี 2 RNA polymerase promoters คือ T3 promoter ข้างหนึ่ง และ T7 promoter อีกข้างหนึ่ง สามารถ transcribe RNA ใน in vitro ใช้ศึกษา translation in vitro

5. Artificial chromosome เป็น Construct เพี่อทำ cloning ใน yeast เรียกว่า Yeast Artificial chromosome / YAC เป็น mini-chromosome ประกอบด้วย 1 centromere, 2 telomeres, origin of replication, และ seletable marker gene(s) ใช้ศึกษา chromosome segregation ระหว่าง meiosis และ cloning DNA ขนาดใหญ่ได้ถึง 150 kb

YAC vector Yeast artificial chromosome vector

DNA manipulative enzymes Enzymes ที่ใช้ตัด DNA อย่าง specific และต้อง บริสุทธิ์ มี 2 ชนิดหลัก 1. Restriction endonucleases 2. DNA ligases

Restriction Endonuclease Type II restriction endonuclease recognize specific nucleotide sequences cut 4-8 nucleotide sequence cut ends 2 types Blunt ends เช่น AluI Stricky ends เช่น EcoRI

Cut ends by restriction endonucleases

DNA ligase เชื่อม DNA โมเลกุลระหว่าง Sticky ends : efficiency ค่อนข้างดี Blunt ends : efficiency น้อยกว่า

DNA library คือ Set ของ DNA clones ที่เก็บไว้ทั้งหมดเพื่อใช้ตรวจหาและศึกษา genes Genomic DNA library : ของ 1 genome ซึ่งคือ genes ทั้งหมดของ สิ่งมีชีวิตใด ๆ Chromosome-specific DNA library : ของ 1 chromosome Complementary DNA library : ของ cDNA

Application ของ Gene manipulation 1. In vitro Site-specific mutagenesis : ศึกษาการทำงานของ genes 2. Physical maps / restriction maps of DNA molecule 3. Nucleotide sequences of gene : หาลำดับ base ของ gene 4. Identification of genes : genetic diseases 5. Human gene therapy : รักษาโรคทางพันธุกรรม

6. Paternity tests : DNA fingerprints, forensic application 7. Production of proteins : hormones, enzymes 8. Transgenic plants : crown gall, herbicide และ insecticide resistant plants 9. Transgenic animals : protein production for human สามารถผลิตเป็นการพาณิชย์ได้

ตัวอย่าง การประยุกต์ใช้ Gene cloning Gene Manipulation ตัวอย่าง การประยุกต์ใช้ Gene cloning GManipulation.ppt

DNA Sequencing

Cloning in Plants Glyphosate-telerant petunia Luciferaseplant พืชเรืองแสง

DNA Fingerprintings : Identify บุคคล / พ่อ-แม่

Gene Therapy : รักษาโรคทางพันธุกรรม

Gene Transfer : ต้อง Identify gene ให้ถูกต้องก่อน โดยเทคนิค gene cloning

Transgenic mouse

Production ของ Somatostatin (action คล้าย growth hormone) ใน recombinant E.coli