Carbohydrate Ramida Amornsitthiwat, M.D. Pichanee Chaweekulrat, M.D.

Hydroxymethylfurfural Part 1 การทดลองที่ 1 ปฏิกิริยาของ mono-, di- และ polysaccharide ใช้น้ำละลาย 0.05 M Xylose, Glucose, Fructose, Lactose และ Sucrose สำหรับการทดลอง A-G คาร์โบไฮเดรตจะถูกดึงน้ำออกโดยกรดแก่ให้สารประกอบ Furfural หรือ hydroxymethylfurfural ซึ่งจะทำปฏิกิริยากับ a- naphthol ใน 95% alcohol (Molisch reagent) ได้สารประกอบสีม่วงแดง (purple compound) A. MOLISCH TEST O - C - H -3H2O strong acid Pentose Hexose Furfural CH2OH- Hydroxymethylfurfural

sugar + a-naphthol purple H2SO4 Sugar 1 ml + Molisch reagent 3 drops (mixed) + gradually drop conc. H2SO4 1 ml 10 x 75 mm sugar + a-naphthol purple H2SO4

B. BENEDICT’S TEST - ทดสอบ REDUCING PROPERTY - BENEDICT’S REAGENT เป็น ALKALINE SOLUTION ของ CuSO4 ซึ่ง Cu++ เป็น MILD OXIDIZING AGENT จะทำปฏิกิริยากับ ALDEHYDE หรือ KETO GROUP ของ OPEN CHAIN FORM ของ ALDOSE หรือ KETOSE RCHO + 2Cu++ + 5OH- RCOO- + Cu2O + 3H2O ตะกอนสีแดงอิฐ

น้ำตาลที่สามารถ REDUCE Cu++ ให้เป็น Cu+ ได้ จะเรียกว่าเป็น REDUCING SUGAR ดังนั้น น้ำตาลที่มี FREE ANOMERIC CARBON จึงเป็น REDUCING SUGAR หมายเหตุ: vitamin C, uric acid, creatinine ให้ผลบวกเท็จ (false positive) ได้

BENEDICT’S SOLUTION 3 ml วิธีทดลอง SUGAR 5 DROPS + BENEDICT’S SOLUTION 3 ml 18 x 150 mm BOIL 30 sec หรือแช่ในน้ำเดือด นาน 3 min PRECIPITATE

+ ได้เร็วกว่า DISACCHARIDES BARFOED 3 ml BOIL 1min หรือแช่ในน้ำเดือด C. BARFOED TEST - ทดสอบ MONOSACCHARIDE - หลักการ MONOSACCHARIDE จะ REDUCE Cu++ ใน ACID SOLUTION ได้เร็วกว่า DISACCHARIDES SUGAR 5 DROPS + BARFOED 3 ml BOIL 1min หรือแช่ในน้ำเดือด นาน 5 min PRECIPITATE

HYDROXYMETHYLFURFURAL RESORCINOL (in HCl) หรือแช่ในน้ำเดือดนาน 1min D. SELIWANOFF TEST - ALDOHEXOSE และ KETOHEXOSE จะถูก DEHYDRATE ด้วยกรดแรงได้ HYDROXYMETHYL FURFURAL แต่สารประกอบที่มี FRUCTOSE จะเกิดปฏิกิริยาเร็วกว่า ALDOHEXOSE 3 H2O OH HC CH O FRUCTOSE HOH2C-HC CH-CH + OH O HYDROXYMETHYLFURFURAL RESORCINOL (in HCl) SUGAR 5 DROPS + SELIWANOFF 3 ml BOIL ~ 10 sec หรือแช่ในน้ำเดือดนาน 1min ORANGE RED OR DEEP CHERRY RED COLOR

- ทดสอบ PENTOSE SUGAR 1 ml + GLACIAL ACETIC 1 ml + ANILINE 3 DROPS E. ANILINE TEST - ทดสอบ PENTOSE acid PENTOSE FURFURAL + ANILINE DARK RED SUGAR 1 ml + GLACIAL ACETIC 1 ml + ANILINE 3 DROPS BOIL เดือดแล้วเอาออก หรือแช่ในน้ำเดือด นาน 1 min

GLUCOSE + 2ADP + 2 Pi 2ETHANOL + 2CO2 + 2ATP F. YEAST FERMENTATION (DEMONSTRATION) - FERMENTATION หรือ การหมัก เป็นขบวนการที่ YEAST สามารถเปลี่ยนน้ำตาลบางชนิดไปเป็น ETHANOL และ CO2 ภายใต้ภาวะ ANAEROBIC GLUCOSE + 2ADP + 2 Pi 2ETHANOL + 2CO2 + 2ATP CO2 SUGAR + YEAST SACCHAROMETER

Red (quinoneimine dye) G. GLUCOSE OXIDASE TEST - ทดสอบ specificity ของกลูโคสต่อ enz. Glucose oxidase GLUCOSE OXIDASE GLUCOSE GLUCONIC ACID + H2O2 H2O2 + PHENOL + AMINO - 4 - ANTIPYRINE PEROXIDASE QUINONEIMINE DYE + 4H2O การทดลอง SUGAR (1 drop) + Glucose oxidase (1 drop) บนจานสี Red (quinoneimine dye)

erythrodextrin + iodine Achroodextrin + iodine deep blue color purple H. IODINE TEST - ทดสอบ polysaccharide ex. starch, glycogen, dextrin amylose + iodine amylopectin + iodine glycogen + iodine amylodextrin + iodine erythrodextrin + iodine Achroodextrin + iodine deep blue color purple dark orange-brown blue (bluish violet) red clear

CONTROL ใช้ น้ำกลั่น 2 ml + 2% IODINE 1-2 หยด สารที่นำมาทดสอบ ได้แก่ 1% น้ำแป้งข้าวเจ้า 1% น้ำแป้งข้าวเหนียว 1% Dextrin 1% Glycogen GLYCOGEN 2 ml + 2% IODINE 1-2 DROP BROWNISH RED CONTROL ใช้ น้ำกลั่น 2 ml + 2% IODINE 1-2 หยด

หลักการของ Chromatography ANALYSIS OF SUGAR BY PAPER CHROMATOGRAPHY ( DEMONSTRATION ) การทดลองที่ 2 หลักการของ Chromatography เป็นวิธีแยกสารโดยอาศัยคุณสมบัติของสาร ได้แก่ คุณสมบัติในการละลายในตัวทำละลายของสาร และ คุณสมบัติในการถูกดูดซับที่แตกต่างกันของสาร - Paper chromatography สาร : น้ำตาลชนิดต่างๆ น้ำยาแยก (developer) : Isopropanol, น้ำ ตัวดูดซับ : กระดาษกรอง

SOLVENT FRONT 1 = GLUCOSE 2 = UNKNOWN STARTING POINT 1 2 Rf = DISTANCE TRAVELED BY SUBSTANCE DISTANCE TRAVELED BY SOLVENT FRONT X 100 Rg = DISTANCE TRAVELED BY SUBSTANCE DISTANCE TRAVELED BY GLUCOSE X 100

ค่า Rg ของน้ำตาลบางชนิด 80 105 32 80 glucose xylose maltose 100 130 47 galactose fructose lactose sucrose

การทดลองที่ 3 โรคเบาหวาน (diabetes mellitus) เป็นโรคที่เกิดจากการที่ร่างกายมีน้ำตาลกลูโคสในเลือดสูงกว่าปกติ กลูโคสจะออกมาในปัสสาวะและสามารถตรวจพบได้โดยวิธี Benedit’s test ในทางการแพทย์ได้นำเอาวิธีดังกล่าวมาตรวจหาน้ำตาลในปัสสาวะเพื่อใช้ในการตรวจคัดกรอง (screening) หาผู้ป่วยเบาหวานและใช้ในการติดตามการผลการรักษา จากการตรวจหาน้ำตาลในปัสสาวะโดยวิธี Benedict’s test ในผู้ป่วย 2 ราย ได้ผลดังนี้ ผู้ป่วยรายที่ 1 - ชายอายุ 30 ปี ร่างกายแข็งแรงดี ไม่มีโรคประจำตัวใดๆ มีประวัติบิดาเป็นเบาหวาน ผลการตรวจปัสสาวะโดยวิธี Benedict’s test ให้ผลบวก ผู้ป่วยรายที่ 2 - หญิงอายุ 28 ปี กำลังตั้งครรภ์ได้ 32 สัปดาห์ ผลการตรวจปัสสาวะโดยวิธี Benedict’s test ให้ผลบวก

ให้นักศึกษาทำการทดลอง เพื่อพิสูจน์ว่าผู้ป่วยทั้งสองมีน้ำตาลชนิดใดออกมาในปัสสาวะโดยใช้ reaction ต่างๆ และผลจาก paper chromatography

คำถามท้ายการทดลอง 1. ผู้ป่วยทั้งสองรายมีน้ำตาลชนิดใดในปัสสาวะ 2. ผู้ป่วยทั้งสองรายนี้น่าจะเป็นโรคเบาหวานหรือไม่ เพราะเหตุใด 3. จงอธิบายสาเหตุที่น่าจะเป็นที่ทำให้มีน้ำตาลในปัสสาวะของผู้ป่วยทั้ง 2 รายนี้ 4. Benedict’s test มีหลักการอย่างไรและให้ผลบวกกับน้ำตาลชนิดใดได้บ้าง 5. เหตุใด sucrose จึงไม่สามารถ reduce Cu2+ ให้เป็น Cu2O เมื่อทำการทดสอบ Benedict’s test 6. เหตุใดแป้งข้าวเจ้าและแป้งข้าวเหนียวจึงให้สีแตกต่างกันเมื่อทดสอบกับ iodine 7. Starch และ Glycogen ทำปฏิกิริยากับ I2 จะได้ผลอย่างไร 8. Starch และ Glycogen มีส่วนที่เหมือนและต่างกันอย่างไร 9. Fermentation คืออะไร

Timetable Introduction to lab carbohydrate 9.00-9.30 9.30-11.35 11.35-11.40 สรุปผลการทดลองส่วนกลาง Quiz 11.40-11.55