การค้นคว้าด้านสมุนไพรและการให้ความสำคัญกับภูมิปัญญาท้องถิ่น 2 วท 102 การพัฒนาวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี การค้นคว้าด้านสมุนไพรและการให้ความสำคัญกับภูมิปัญญาท้องถิ่น 2

วิเคราะห์สารต้านอนุมูลอิสระ ด้วยวิธี DPPH assay สาร Trolox (โทรลอกซ์) โครงสร้างแสดงดังรูป Trolox (โทรลอกซ์)

วิเคราะห์สารต้านอนุมูลอิสระ ด้วยวิธี DPPH assay การเตรียมสารมาตรฐาน โทรลอกซ์ (Trolox) 1. เตรียมสารละลายมาตรฐานโทรลอกซ์ที่ความเข้มข้นต่างๆ (0.0-0.2 มิลลิโมล) โดยเจือจางด้วยน้ำกลั่น (ความเข้มข้นต้องอยู่ในช่วงร้อยละ 20 – 100 ของการยับยั้ง (% inhibition)) 2. ปิเปตสารละลาย DPPH 0.1 mM ปริมาตร 1.5 มิลลิลิตร ลงในหลอดทดลอง 10 อัน เติมสารละลายมาตรฐานโทรลอกซ์แต่ละความเข้มข้น ปริมาตร 0.5 มิลลิลิตร ผสมให้เข้ากันด้วยเครื่อง vortex mixture ตั้งทิ้งไว้ในที่มืดที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 30 นาที แล้วนำไปวัดค่าการดุดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 517 นาโนเมตร (ทำการทดลองซ้ำ 3 ครั้ง)

วิเคราะห์สารต้านอนุมูลอิสระ ด้วยวิธี DPPH assay การเตรียมสารมาตรฐาน โทรลอกซ์ (Trolox) 3. สำหรับหลอดควบคุมใช้เมทานอลปริมาตร 0.5 มิลลิลิตร แทนสารละลายมาตรฐานโทรลอกซ์ ส่วนหลอดแบลงค์ใช้เมทานอล 4. คำนวณหาร้อยละของการยับยั้ง (% inhibition) จากสูตรต่อไปนี้ ร้อยละของการยับยั้ง = [ A517control – A517 test sample ] x 100 A517control

วิเคราะห์สารต้านอนุมูลอิสระ ด้วยวิธี DPPH assay การเตรียมสารมาตรฐาน โทรลอกซ์ (Trolox) 5. นำร้อยละของการยับยั้งคำนวณได้ของแต่ละความเข้มข้นไปเขียนกราฟมาตรฐานต่อไปนี้ ดังตัวอย่าง

วิเคราะห์สารต้านอนุมูลอิสระ ด้วยวิธี DPPH assay การวิเคราะห์สารตัวอย่าง 1. เจือจางตัวอย่างด้วยเมทานอลให้ได้ความเข้มข้น 0.1-1.0 มิลลิกรัม/มิลลิลิตร 2. ทำการวิเคราะห์เหมือนสารละลายมาตรฐานโทรลอกซ์ (ข้อ 2-6) โดยใช้ตัวอย่างแทนสารละลายมาตรฐานโทรลอกซ์ จะได้ค่า IC50 ของตัวอย่างที่วิเคราะห์

วิเคราะห์สารต้านอนุมูลอิสระ ด้วยวิธี DPPH assay การวิเคราะห์สารตัวอย่าง 3. คำนวณหาความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระของตัวอย่างที่วิเคราะห์เทียบกับสารละลายมาตรฐานโทรลอกซ์ เรียกว่า TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity; mM Trolox/g smaple) ซึ่งค่านี้แสดงถึงความเข้มข้นของโทรลอกซ์ที่มีความสามารถต้านอนุมูลอิสระเท่ากับสารที่ทดสอบ 1.0 มิลลิกรัม ดังสูตรต่อไปนี้ Antioxidant activity (TE mmol/g ของตัวอย่าง) คำนวณจาก = IC50 ของ trolox (mmol/L) IC50 ของตัวอย่างที่วิเคราะห์(mg/ml)

วิเคราะห์ปริมาณสารประกอบฟีนอลิกทั้งหมด total phenolic contents เริ่มจากการเตรียมสารมาตรฐาน คือ แกลลิค เอซิด (gallic acid) 1. เตรียมสารละลายกรดแกลลิคความเข้มข้น 1000 ppm โดยชั่งกรดแกลลิค 100 มิลลิกรัม ละลายในเอธานอล ร้อยละ 95 ปริมาตร 100 มิลลิลิตร

วิเคราะห์ปริมาณสารประกอบฟีนอลิกทั้งหมด การเตรียมสารมาตรฐาน (ต่อ) 2. ทำการ dilution สารละลายที่ได้ในข้อ 1 โดยการปิเปตมา 0.5, 1, 1.5, 2, 4, 6 และ 8 มิลลิลิตร ลงในหลอดทดลอง แล้วปรับปริมาตรด้วยน้ำกลั่นให้ครบ 8 มิลลิลิตร จะได้ความเข้มข้นของสารละลายกรดแกลลิคเป็น 50, 100, 150, 200, 400, 600, 800 ppm ตามลำดับ

วิเคราะห์ปริมาณสารประกอบฟีนอลิกทั้งหมด การเตรียมสารมาตรฐาน (ต่อ) 3. ปิเปตสารละลายแต่ละความเข้มข้นในข้อ 1) และ 2) มา 0.25 มิลลิลิตร เติมน้ำกลั่น 3 มิลลิลิตร เติมสาร Folin-Ciocalteu' s phenol 0.25 มิลลิลิตร และเติมสารละลายโซเดียมคาร์บอเนตร้อยละ 7 อีก 2.5 มิลลิลิตร ผสมให้เข้ากันด้วยเครื่อง Vortex mixture

วิเคราะห์ปริมาณสารประกอบฟีนอลิกทั้งหมด การเตรียมสารมาตรฐาน (ต่อ) 4. ตั้งทิ้งไว้ที่อุณหภูมิห้อง 30 นาที แล้วนำไปวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 760 นาโนเมตร โดยใช้เอธานอล ร้อยละ 95 เป็นแบลงค์ (blank) 5. นำค่าการดูดกลืนแสงที่ได้ในแต่ละความเข้มข้นไปเขียนกราฟมาตรฐานต่อไป

การสร้างกราฟมาตรฐานกรดแกลลิค สร้างกราฟมาตรฐานจากข้อมูลที่วัดค่าการดูดกลืนแสดงได้ เมื่อได้กราฟแล้ว คลิกที่ linear คลิกที่ option คลิกเครื่องหมายถูกที่ display equation on chart และ display R-squared แล้วคลิกที่ OK ก็จะได้กราฟพร้อมสมการ และค่า R2

กราฟมาตรฐานกรดแกลลิค ค่าการดูดกลืนแสงที่ 760 nm ความเข้มข้นกรดแกลลิค (ppm)

วิเคราะห์ปริมาณสารประกอบฟีนอลิกทั้งหมด วิธีการวิเคราะห์ตัวอย่าง 1. นำตัวอย่าง (กรณีของเหลว) นำมา 10 มิลลิลิตร นำไปปรับปริมาตรด้วยเอธานอล ร้อยละ 95 ให้ครบ 50 มิลลิลิตร แล้วนำไปหมุนเหวี่ยงที่ 5,000 rpm เป็นเวลา 10 นาที แยกเอาเฉพาะสารละลายใสไปวิเคราะห์ต่อไป 2. ปิเปตสารละลายใสที่ได้ 0.25 มิลลิลิตร ลงในหลอดทดลอง เติมน้ำกลั่น 3 มิลลิลิตร เติมสาร Folin-Ciocalteu’s phenol 0.25 มิลลิลิตร และเติมสารละลายโซเดียมคาร์บอเนต ร้อยละ 7 อีก 2.5 มิลลิลิตร ผสมให้เข้ากันด้วยเครื่อง Vortex mixture

วิเคราะห์ปริมาณสารประกอบฟีนอลิกทั้งหมด วิธีการวิเคราะห์ตัวอย่าง (ต่อ) 3.ตั้งทิ้งไว้ที่อุณหภูมิห้อง 30 นาที แล้วนำไปวัดค่าดูดกลืนแสงที่ 760 นาโนเมตร โดยใช้เอธานอล ร้อยละ 95 เป็นแบลงค์ นำค่าดูดกลืนแสงที่ได้ไปแทนค่า Y ในสมการกราฟ มาตรฐาน เพื่อหาค่า X แล้วนำค่า X คูณด้วยค่า dilution factor ก็จะได้ค่าความเข้มข้นของสารประกอบฟีนอลทั้งหมดในตัวอย่าง มีหน่วยเป็น ppm หรือไมโครกรัมต่อกรัม (as gallic acid)