Thalassemia screening test Pichanee Chaweekulrat MD.

Thalassemia and abnormal Hb 1. ความผิดปกติเชิงปริมาณ ทำให้มีการผลิต globin chain ชนิดใดชนิดหนึ่ง (หรือมากกว่าหนึ่งชนิด) ลดลง เรียกว่า thalassemia สร้าง α-globin ลดลง เรียกว่า α-thalassemia สร้าง β-globin ลดลง เรียกว่า β-thalassemia

Thalassemia and abnormal Hb ความผิดปกติของ Hb แบ่งออกเป็น 2 ลักษณะ คือ 2. ความผิดปกติเชิงคุณภาพ ทำให้มี abnormal Hb ที่พบบ่อยและสำคัญในประเทศไทย คือ Hb E เกิดจาก missense mutation ของ β-globin gene เกิด Hb E ที่ไม่เสถียร และมีการสร้าง β-globin ลดลง

Thalassemia and abnormal Hb มีอาการแสดงที่หลากหลาย ตั้งแต่ไม่มีอาการ, ภาวะซีดเล็กน้อย, ภาวะซีดรุนแรง ร่วมกับตัวเหลือง ตับม้ามโต หรือ เสียชีวิต Hydrops fetalis

Thalassemia screening test เพื่อคัดแยกผู้ที่เป็นพาหะออกจากคนปกติ วิธีที่นิยมใช้ในปัจจุบันมี 3 วิธี ดังนี้ 1. การตรวจค่าดัชนีเม็ดเลือดแดง 2. DCIP precipitation test 3. One tube osmotic fragility test (OF Test) การตรวจคัดกรองในปัจจุบันจะใช้ 2 วิธีร่วมกันคือ MCV หรือ OF Test ร่วมกับ DCIP

Thalassemia screening test 1. การตรวจค่าดัชนีเม็ดเลือดแดง ที่สำคัญคือ MCV (mean corpuscular volume) ซึ่งบอกขนาดของเซลล์เม็ดเลือดแดง ผู้ป่วยและส่วนใหญ่ของผู้ที่เป็นพาหะธาลัสซีเมีย จะมีค่า MCV น้อยกว่า 80 fL (normal 80-100 fL) ภาวะโลหิตจางอื่นๆ ที่ทำให้เม็ดเลือดแดงมีขนาดเล็กลง เช่น ภาวะขาดธาตุเหล็ก จะทำให้มีค่า MCV ต่ำได้เช่นเดียวกัน ค่า MCV ห้อง lab พยาธิวิทยาคลินิคจะวิเคราะห์ให้

Lab ที่ต้องทำวันนี้ Thalassemia screening test subject 1 คน/โต๊ะ unknown 2 หลอด/ห้อง (unknown 1, unknown 2)

Lab ที่ต้องทำวันนี้ Thalassemia screening test DCIP precipitation test One tube osmotic fragility test (OF Test)

Blood sample preparation Subject 1 คน/โต๊ะ เจาะเลือดจากปลายนิ้วโดยใช้ lancing device ใส่ใน capillary tube อุปกรณ์ที่ใช้ - lancing device และ lancet Capillary tube (hematocrit tube) 2 หลอด Eppendorf tube ถุงมือ สำลีแห้ง 70% alcohol ที่ทิ้งขยะ lancet lancing device

Blood sample preparation วิธีการประกอบ lancing device และ lancet 1 2 ปรับความลึก (ระดับ 3-4) ใส่ lancet เข้าที่ปลายของ lancing device 4 3 ดึง lever ขึ้น ถอดปลอก lancet ออก 5 จรดที่ปลายนิ้วแล้วเจาะเลือดโดยกดปุ่ม push

Blood sample preparation Subject 1 คน/โต๊ะ เจาะเลือดจากปลายนิ้วโดยใช้ lancing device ใส่ใน capillary tube - ใช้สำลีชุบแอลกอฮอล์เช็ดบริเวณปลายนิ้ว ที่จะทำการเจาะเลือด รอจนแห้ง - ใช้ lancing device เจาะเลือดจากนิ้วกลาง หรือนิ้วนางห่างจากปลายเล็บประมาณ 4-5 มม. แล้วเช็ดเลือดหยดแรกออกด้วยสำลีแห้ง - ค่อยๆบีบไล่เลือดไปที่บริเวณปลายนิ้ว ให้เข้า ไปใน capillary tube ให้ได้ 2 หลอด (ปริมาณ~ 3/4 ของหลอด) - ใช้สำลีกดห้ามเลือดบริเวณปลายนิ้ว ประมาณ 5 นาที

Blood sample preparation 2. นำเลือดใส่ลงในหลอดบรรจุสารตัวอย่าง (eppendorf tube)

Blood sample preparation

Thalassemia screening test 1. DCIP precipitation test ใช้ทดสอบ Hb ผิดปกติชนิดต่างๆ โครงสร้างของ Hb E ไม่แข็งแรง Hb E ทำปฏิกิริยากับ DCIP reagent ได้ง่ายและเร็วกว่า Hb ชนิดอื่น ถูกออกซิไดซ์ได้เป็นโกลบินสายเดี่ยวที่มีหมู่ sulfhydryl (-SH) เกิดเป็นตะกอน ให้ผลบวกกับ test นี้ 100% Hb H(4), Hb Bart’s(4) อาจทำให้ขุ่นเล็กน้อยได้

Thalassemia screening test 1. DCIP precipitation test : Kit reagent ที่ใช้ KKU-DCIP-Clear Reagent Kit KKU-DCIP reagent 2 ml Clearing solution

Thalassemia screening test 1. DCIP precipitation test : วิธีที่ทดสอบ ใช้ automatic pipette ดูดเลือด 20 μl ใส่ใน KKU-DCIP reagent 2 ml ผสมโดยพลิกกลับไปมา 2-3 รอบให้เข้ากัน แช่ใน water bath ที่ 37°C นาน 15 นาที เติม clearing solution 20 μl แล้วทิ้งไว้ 3 นาที จึงอ่านผล

Thalassemia screening test 2. DCIP precipitation test : การอ่านผล ผลบวก สารละลายขุ่น ผลลบ สารละลายใส

Thalassemia screening test 2. One tube osmotic fragility test (OF Test) วัดปริมาณการแตกของเม็ดเลือดแดงใน hypotonic saline solution (0.36% NaCl) การแตกของเม็ดเลือดแดง(Osmotic fragility) ขึ้นอยู่กับ อัตราส่วนของพื้นที่ผนังเซลล์ต่อปริมาตรเซลล์ หรือ surface-to-volume ratio เม็ดเลือดแดงปกติ จะแตกหมด แต่เม็ดเลือดแดงของผู้ป่วย หรือผู้ที่เป็นพาหะ จะแตกไม่หมด ไม่สามารถแยกธาลัสซีเมียออกจากภาวะโลหิตจางจากการธาตุเหล็กได้

Thalassemia screening test 2. One tube osmotic fragility test (OF Test) : ผลการทดสอบ Positive ผู้ป่วยโรค thalassemia และ homozygous Hb E ให้ผลบวก 100% β-thalassemia trait ให้ผลบวก 90% α-thalassemia 1 trait ให้ผลบวก 93% พบในภาวะอื่นที่เม็ดเลือดแดงมีการติดสีจางเช่นเดียวกับโรคธาลัสซีเมีย เช่น ภาวะซีดจากการขาดธาตุเหล็ก False Positive มีผลบวกลวงกับคนปกติ 5%

Thalassemia screening test 2. One tube osmotic fragility test (OF Test) : วิธีทดสอบ ใช้ automatic pipette ดูดเลือด 20 μl ใส่ใน KKU-OF reagent 2 ml ผสมโดยพลิกกลับไปมา 2-3 รอบให้เข้ากัน ตั้งทิ้งไว้ที่อุณหภูมิห้อง 30 นาที แล้วอ่านผล

Thalassemia screening test 2. One tube osmotic fragility test (OF Test) : การอ่านผล ผลบวก สารละลายขุ่น ส่วนใหญ่ของเม็ดเลือดแดงผู้ป่วยแตกไม่หมด ผลลบ สารละลายใสสีแดง เม็ดเลือดแดงคนปกติแตกหมด

Confirmatory test Hemoglobin typing Iron studies : serum ferritin, serum iron, total iron binding capacity (TIBC)

Thalassemia screening test OF + DCIP DCIP positive OF positive DCIP negative OF negative DCIP negative แยกจากภาวะโลหิตจางจากการขาดธาตุเหล็ก Hb typing normal

Thalassemia screening test MCV + DCIP DCIP positive MCV < 80 fL DCIP negative MCV > 80 fL DCIP negative แยกจากภาวะโลหิตจางจากการขาดธาตุเหล็ก Hb typing normal

Thalassemia screening test บันทึกผลการทดลองของ subject และ unknown ลงในคู่มือปฏิบัติการของตนเอง ดูค่าดัชมีเม็ดเลือดแดงของ unknown จากอาจารย์ประจำห้อง แล้วแปรผล กรอกข้อมูลลงในตารางบันทึกผลการทดลองประจำห้อง (ตามความสมัครใจ)

Timeline 8.00 – 8.40 น. Talk lab และทำ lab 8.40 – 8.50 น. แบบฝึกหัด (ให้นักเรียนแบ่งกลุ่มละ 2 โต๊ะ+แจกใบงานชุดที่ 1) 8.50 – 9.15 น. ให้นักศึกษาในแต่ละห้องปฏิบัติการนำแบบฝึกหัดมา อภิปรายร่วมกัน 9.15 – 12.00 น. KSA blood protein and hemoglobin