Single nucleotide polymorphism(S) or mutation(S) of gene in haemostasis Dr. Worawan Chumpia Faculty of Associated Medical Sciences Khon Kaen University

Objective 1.คำจำกัดความ SNP(s) หรือ mutation(S) 2. ชนิดของ SNP(s) 4. การนำเอา bioinformatic tools มาช่วยในการวิเคราะห์ผล

Single nucleotide polymorphism(S) or mutation(S) of gene in haemostasis ทำไมมนุษย์แต่ละคน แต่ละเชื้อชาติถึงมีความแตกต่างกัน ความสูง สีผิว เส้นผม เลนส์ตา ความรุนแรงของโรค Identical Twin ?

Nucleic alteration Nucleic alteration or DNA polymorphism or genetic polymorphism : การเปลี่ยนแปลงรหัสพันธุกรรม หรือความหลากหลายของดีเอ็นเอที่เป็นลักษณะปกติของประชากร ความหลากหลาย เกิดจาก การเปลี่ยนแปลงของลำดับเบสในจีโนมของมนุษย์ ทำให้แต่ละบุคคลมีลำดับเบส ณ ตำแหน่งเดียวกันบนโครโมโซมหนึ่งแตกต่างกัน หรือ อัลลีล (allele) ที่แตกต่างกัน

Nucleic alteration ความหลากหลายทางพันธุกรรมเกิดจาก การกลายพันธุ์ (mutation) ที่เกิดขึ้นตามธรรมชาติ มีการคัดเลือกพันธุ์ตามธรรมชาติ(natural selection) มีการถ่ายทอดจากรุ่นหนึ่งไปสู่อีกรุ่นหนึ่ง มีค่าความถี่  ร้อยละ 1

Nucleic alteration Generation 1 ความถี่ของการถ่ายทอดการกลายพันธุ์ ในประชากรในแต่ละรุ่น  ร้อยละ 1 Generation n Single Nucleotide Polymorphism (SNP)

Mutations การกลายพันธุ์ (mutation) ที่ตำแหน่งสำคัญของยีน สามารถถ่ายทอดจากรุ่นหนึ่งไปสู่อีกรุ่นหนึ่ง เป็นการกลายพันธุ์ที่มีลักษณะการแสดงออก(phenotype) ต่างจากคนปกติ และสามารถก่อให้เกิดโรคได้ มีค่าความถี่ < ร้อยละ 1

Type of SNPs ขึ้นกับตำแหน่งของความหลากหลาย(polymorphisms) บนยีน ที่มีผลต่อการควบคุม (regulation) และการทำหน้าที่ (function) ของโปรตีนนั้นๆ 5’ UTR intron1 intron2 3’ UTR Exon1 Exon 2 Exon 3

Type of SNPs 1. SNP บริเวณ 5’UTR มีผลทำให้เกิดการสร้างโปรตีนได้มากขึ้นหรือลดลง 2. บริเวณแอกซอนต่างๆมีผลทำให้โปรตีนที่สร้างขึ้นมาทำงานปกติ หรือลดลง - Synonymous SNP or hidden mutation or silent mutation - Nonsynonymous SNP alter amino acid: missense mutation, nonsense mutation, etc.

Type of SNPs (continued) 3. บริเวณอินทรอน (noncoding sequence, or intervening sequence(IVS) )  Variable number of tandem repeat (VNTR): การมีจำนวนชุดที่แตกต่างกันของลำดับเบสที่เหมือนกันเรียงต่อกัน

Type of SNPs (continued) minisatellite :การซ้ำกันของลำดับเบสเป็นชุดๆ แต่ละชุดมีจำนวนเบส 10-100 เบส  microsatellite :การซ้ำกันของลำดับเบสเป็นชุดๆ แต่ละชุดมีจำนวนเบส 2-6 เบส

Type of SNPs (continued) Minisatellite - GCATCGGACCAATCGATCGGACCAATCGATCGGACC AATCG (n=3) - GCATCGGACCAATCGATCGGACCAAT CGATCGGACCAATCGATCGGACCAATCG(n=4) - GCATCGGACCAATCG (n=1)  Microsatellite ATTACACACACACAATTTT (n=5) ATTACACACACACACACACAATTT (n=8) ATTACACACACACACACACACACACAATTTT (n=11)

Type of SNPs (continued) 4.บริเวณ splicing junction มีผลทำให้โปรตีนที่สร้างขึ้นมาผิดปกติ frameshift mutation, deletion, insertion intron

Type of SNPs (continued) 5. บริเวณ 3’UTR หรือ poly A tail ทำให้โปรตีนที่ถูกสร้างขึ้นมาถูกทำลายเร็วกว่าปกติ AAAAAAAAAAAA CACAAACCCCAAAA protease

ความสำคัญของความหลากหลายทางพันธุกรรม 1. ตรวจหายีนที่มีความสัมพันธ์กับโรค 2.พัฒนายาที่มีความจำเพาะ (pharmacogenomics) กับกลุ่มบุคคลในแต่ละโรค 3.การเลือกวิธีการรักษาของแต่ละบุคคลให้ตรงกับโรค 4.การป้องกันและการปฏิบัติตัวของบุคคลที่มียีนเกี่ยวข้องกับโรคต่างๆ

How to find dbSNPs related with disease? Search engine Google NCBI

DatabaseSNP Human Genome base

Concept study of Monogenic disease Gene1 Drug1 Responder Nonresponder Acyclovir  HIV disease Reverse transcriptase

Concept study of polygenic disease PEDIGREE Marker locus TRAIT RFLP SSCP VNTR -(CA)n etc Association - Disease - population Linkage Disequilibrium (LD) Causal Locus - Map location - DNA sequences

Single nucleotide polymorphism(S) or mutation(S) in haemostasis Platelet(s) GP Ia, Ib GP IIb GP IV

Single nucleotide polymorphism(S) or mutation(S) in haemostasis Coagulation factor (S) Factor I Factor II Factor III Factor V Factor VII Factor VIII Factor IX Factor X Factor XI, XII Factor XIII

Single nucleotide polymorphism(S) or mutation(S) in haemostasis Fibrinolytic system Plasminogen Plasmin t-PA PAI Antiplasmin

Single nucleotide polymorphism(S) or mutation(S) in haemostasis Natural inhibitor (S) Protein C Protein S Antithrombin Throbomodulin TFPI

PLatelet(s) Adhesion Activation Secretion Aggregation

Coagulation factor(s)

Natural inhibitor(s)

Tissue factor pathway inhibitor (TFPI) Natural inhibitor(s): Tissue factor pathway inhibitor (TFPI)

การตรวจทางห้องปฏิบัติการที่ใช้ในการตรวจหา SNPs 1.Restriction fragment length polymorphism (RFLP) or PCR-RFLP 2.Allele specific PCR amplification 3.Single strand conformation polymorphism (SSCP) 4. Heteroduplex mobility assay (HMA) 5. 5’ nuclease reaction

การตรวจทางห้องปฏิบัติการที่ใช้ในการตรวจหา SNPs 6. Molecular beacons 7. Pyrosequencing 8. Allele specific oligonucleotide hybridization 9. Invader assay 10. Sequencing 11. Microarray : high throughput technology 12. MALDI-TOF Mass spectometry: high throughput technology

Deep Vein Thrombosis (DVT) หมายถึงภาวะที่มีลิ่มเลือดไปอุดตันที่บริเวณหลอดเลือดดำชั้นลึก การที่มีลิ่มเลือดเข้าไปอุดตันทำให้ไปขัดขวางการไหลเวียนของเลือด และเมื่อมีการแตกของลิ่มเลือดเป็นชิ้นเล็กๆ (thromboembolism) เข้าไปในกระแสเลือดจะเข้าไปอุดกั้นส่วนต่างๆของร่างกาย เช่น สมอง ปอด หัวใจ ซึ่งอาจทำให้เป็นอันตรายแก่ผู้ป่วยได้

สาเหตุ 1. ทางพันธุกรรม เช่น - protein C - protein S - antithrombin III - factor V Leiden - prothrombin G20210A mutation 2. ได้รับมา (acquired type):

ความผิดปกติ เชื้อชาติ Thai Chinese Caucasian Protein S deficiency Protein C deficiency Antithrombin deficiency Factor V Leiden Prothrombin gene mutation Elevated fibrinogen Elevated factor VIII Elevated factor IX Hyperhomocysteinnemia Antiphospholipid antibodies Malignancy 12.3 % 8.9 % 4.7 % 0 % 0% 33.3 % 30.4 % 26.8 % 5 % 10 % 19 % 8-33 % 4-19 % 4 % - 16-27 % 1-3 % 3-5 % 1 % 20 % 6 5 3 % 25 % 10-20 % 9-25 %

Materials and Methods Criteria 1.1 กลุ่มควบคุม คนปกติที่ได้ทำการตรวจวัดเพื่อหาระดับแอคทิวิตีของโปรตีนซี ซึ่งมีค่าอยู่ในช่วงระหว่าง 70-110% ซึ่งได้ทำการตรวจยีนของโปรตีนซีและทราบว่าลำดับนิวคลีโอไทด์ในจีโนมทั้งหมดของโปรตีน ซี ปกติ นำมาใช้เป็นตัวควบคุมในการทำ heteroduplex mobility assay (HMA) ทุกแอกซอนของโปรตีนซี 1.2 กลุ่มผู้ป่วย เป็นผู้ป่วยที่มีภาวะหลอดเลือดดำอุดตันจากลิ่มเลือดที่เข้ารับการรักษาที่โรงพยาบาล และได้รับการวินิจฉัยว่าเป็น DVTโดยที่มีผลบวกต่อเกณฑ์ที่ใช้ในการศึกษาครั้งนี้อย่างน้อย 1 อย่าง ซึ่งเกณฑ์ที่ใช้ในการศึกษาของกลุ่มผู้ป่วย DVT คือ 1)มีประวัติครอบครัวซึ่งมีภาวะ DVT 2)อาการแสดงของการเกิดภาวะลิ่มเลือดอุดตันที่แขน,ขา หรือตามอวัยวะอื่น ๆอย่างน้อย 1 ครั้ง 3)ให้ผลบวกต่อการตรวจพิเศษ 4)ระดับแอกทิวิตีของโปรตีน ซี ต่ำหรืออยู่ในช่วง borderline

Materials and Methods 2 สิ่งส่งตรวจ เจาะเลือดใส่ 3.2% โซเดียมซิเตรดนำไปปั่นแยกพลาสมา นำพลาสมาไปเก็บไว้ที่ -70oC เพื่อรอการตรวจวัดระดับแอกทิวิตี และระดับแอนติเจนของโปรตีนเอส ส่วนเม็ดเลือดขาวนำมาสกัดดีเอ็นเอโดยใช้ชุดสกัดดีเอ็นเอ Genomic DNA Mini Kit (Geneaid Biotech)

Materials and Methods 3.1 การทำ polymerase chain reaction (PCR) - การเพิ่มจำนวนชิ้นส่วยดีเอ็นเอในแต่ละแอกซอนของจีนโปรตีนซี ด้วยวิธี PCR และตรวจผลการเพิ่มจำนวนดีเอ็นเอ : initial denaturation 95C, 4 mins -Denaturation 95 C, 30 S - annealing 62 C, 30 S - extention 72 C, 30 S final extention: 72 C, 10 mins 30 rounds

Methods PCR products 1.5% Agarose Gel

Materials and Methods 3.2 ทำ Heteroduplex Mobility Analysis (HMA) Screen SNPs, mutations ส่วนประกอบ Control Heteroduplexes Unknown 10X Anneal buffer 1 1 1 PCR ของกลุ่มควบคุม 8 4 - PCR ของกลุ่มผู้ป่วย - 4 8 Loading dye 1 1 1 Total volume 10 µl 10 µl 10 µl

Methods -นำ microtube ที่เติมส่วนผสมต่าง ๆ เรียบร้อยแล้วมาทำให้ความร้อนที่อุณหภูมิ 95 C เป็นเวลา 5 นาที โดยใช้เครื่อง thermal cycle เพื่อทำให้สายคู่ของดีเอ็นเอ (dsDNA) แยกออกกลายเป็นสายเดี่ยวของดีเอ็นเอ (ssDNA) จากนั้นนำมาแช่ในน้ำแข็งทันทีเป็นเวลา 10 นาที

Heteroduplex mobility assay (HMA)

Methods การตรวจกรองมิวเตชั่นหรือโพลิมอร์ฟิสม โดยเตรียม non-denaturing polyacrylamide gel มีขั้นตอนดังนี้ 10% PAGE, 2.6% C ส่วนประกอบ ปริมาตร -30% acrylamide-bis 4.0 ml -10XTBE 0.5 ml -10%APS 100 ul - TEMED 10 ul - dH2O 5.5 ml และ urea 0.5 g set PAGE 1 hr

Methods ตัวอย่างส่งตรวจที่ตรวจพบว่ามีการแถบดีเอ็นเอที่ผิดปกติ จากการตรวจกรองหามิวเตชั่นของโปรตีน ซี ด้วย Heteroduplex mobility assay (HMA) นำมาตรวจยืนยันด้วยวิธี sequencing ต่อไป

Methods นำผลที่ได้จากการทำ Sequencing ของตัวอย่างส่งตรวจมาเปรียบเทียบกับผล Sequencing ของคนปกติ เพื่อตรวจหาชนิดของลำดับเบสที่ผิดปกติไป โดยนำมาวิเคราะห์การเรียงตัวของ นิวคลีโอไทด์ด้วยโปรแกรมสำเร็จรูป BioEdit Download BioEdit มาติดตั้งใน drive C Hall, T.A. 1999. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucl. Acids. Symp. Ser. 41:95-98.

Methods เปรียบเทียบ text file และ chromatogram file ระหว่างคนปกติกับผู้ป่วย โดยใช้ Bioedit program

Result 14% PAGE, 2.6% C, 70 Volt,8 hrs, 4C

Result 14% PAGE, 2.6% C, 70 Volt,8 hrs, 4C

Result M 1 1* M 2 2* C SSDNA He Ho 14% PAGE, 2.6% C, 70 Volt,8 hrs, 4C

Methods

Wild type Heterozygote Mutant

PAGE Wild type Heterozygote

Result จากการนำ bioinformatic tool มาใช้ทำให้สามารถทราบตำแหน่งที่นิวคลิโอไทด์เปลี่ยนแปลงไป amino acid เปลี่ยนแปลงหรือไม่