พันธุกรรมของแบคทีเรีย 2 ดร.สุทธิเดช ปรีชารัมย์

ทบทวน DNA สารพันธุกรรม RNA deoxyribose ribose A, G น้ำตาล 5 คาร์บอน Nitrogenous base Phosphate group purine pyrimidine C, T (U)

หน้าที่ของ RNA แต่ละชนิดในโปรคาริโอต rRNA เป็นองค์ประกอบของไรโบโซม (70S) -Large subunit=50S (ประกอบด้วย 23S rRNA+5S rRNA+34 proteins) -Small subunit=30S (ประกอบด้วย 16S rRNA+21 proteins) tRNA ทำหน้าที่นำกรดอะมิโนมายังไรโบโซม mRNA เป็นแม่แบบในการสังเคราะห์โปรตีน

การจำลองตัวของ DNA ในโปรคาริโอต มีลักษณะดังนี้ 1. เป็นแบบกึ่งอนุรักษ์ (semiconservative) 2. เป็นแบบสองทิศทาง (bidirectional) 3. DNA เส้นใหม่ที่ถูกสร้างขึ้น จะถูกสังเคราะห์ในทิศทาง 5’-->3’

DNA polymerase ใน E. coli มี 3 ชนิด คือ DNA polymerase I DNA polymerase II DNA polymerase III ขั้นตอนของ DNA replication 1. Initiation 2. Elongation 3.Termination

การเกิด DNA replication template AAGTCAGGCTAGC 3’ 5’ 5’ TTCA 3’ New strand DNA เส้นใหม่ที่เกิดขึ้น จะมีการสังเคราะห์ในทิศทาง 5’-->3’ DNA เส้นใหม่จะมีลำดับเบส เป็นเบสคู่สม (complementary base)กับเส้นเดิม (template) A T G C

RNA synthesis หรือ Transcription

หน้าที่ของ RNA polymerase หาลำดับเริ่มต้น (initiation site) บน DNA เปิดเกลียวของ DNA จากเส้นคู่ ไปเป็นเส้นเดี่ยว สังเคราะห์ RNA โดยใช้ DNA เส้นเดี่ยวเป็นแม่แบบ DNA template--> minus (-) strand --> antisense strand Non template strand--> plus (+) strand--> coding strand--> sense strand

4. เลือก ribonucleoside triphosphate ที่ถูกต้องมาต่อ โดยเร่งการสร้าง phosphodiester bonds ระหว่าง 5’ triphosphate กับ 3- hydroxyl group RNA polymerase จะสังเคราะห์ RNA ในทิศทาง 5’--> 3’ โดยทำงานแบบทิศทางเดียว (unidirectional) การสังเคราะห์เริ่มต้นจนจบ ใช้ RNA polymerase เพียงโมเลกุลเดียว

RNA ที่พบในสิ่งมีชีวิตโปรคาริโอต Type % content Size MW # nucleotides rRNA 80 23S 1.2x106 3700 16S 0.55x106 1700 5S 3.6x106 170 tRNA 15 4S 2.5x106 75 mRNA 5 varies DNA dependent RNA polymerase ทำหน้าที่สังเคราะห์ RNA ในโปรคาริโอต (E. coli) มีเพียงชนิดเดียว

DNA + strand 5’ CGCTATAGCGTTT 3’ DNA - strand 3’ GCGATATCGCAAA 5’ RNA transcript 5’ CGCUAUAGCGUUU 3’

ขั้นตอนการ transcription เป็น mRNA 1. Initiation 2. Elongation 3.Termination 1. Initiation มีจุดเริ่มต้นเรียกว่า promoter โดยใน prokaryote มี 2 แห่ง คือ 1. TATAAT (pribnow box) อยู่ตำแหน่ง -35 ด้าน 5’ 2. TTGACA อยู่ตำแหน่ง -35 ด้าน 5’

การนับตำแหน่งจะนับบน coding strand DNA โดยนับ start point เป็น +1 และก่อนหน้านั้นทางปลาย 5’ เป็น-1, -2, -3…….

เริ่มต้นด้วย RNA polymerase เข้าจับที่ตำแหน่ง -35 จากนั้นเคลื่อนที่ไปยังตำแหน่ง -10 แล้วทำการคลายเกลียว DNA การเริ่มต้นสังเคราะห์ RNA จะเริ่มต้นจากปลาย 5’ ที่เป็น purine (A หรือ T) เสมอ โดยไม่ต้องการ primer

2. Elongation เกิดขึ้นหลังจากมีการสร้าง phosphodiester bonds แรกขึ้นมา 3. Termination Termination ถูกควบคุมโดย stop signal ที่พบบน DNA template ซี่งเป็นบริเวณที่เป็น GC-rich region ที่มีลำดับเบสเป็น inverted repeat และตามด้วย AT-rich region

การสังเคราะห์ tRNA และ rRNA การสังเคราะห์ tRNA และ rRNA จะเป็นการดัดแปลงจาก mRNA spacer 16S rRNA tRNA 5S rRNA 23S rRNA

การดัดแปลง RNA การตัด (splicing) การเติม CCA เข้าที่ปลาย 3’ ของ tRNA การดัดแปลงเบสและหน่วยไรโบสของ rRNA

added removed removed removed

Protein synthesis หรือ Translation

ภายหลังการถอดรหัส (transcription) ได้ RNA ชนิดหนึ่งคือ mRNA ภายหลังการถอดรหัส (transcription) ได้ RNA ชนิดหนึ่งคือ mRNA หลังจากนั้น mRNA จะถูกนำไปสังเคราะห์โปรตีน เรียกกระบวนการนี้ว่า กระบวนการแปลรหัส (translation) โมเลกุลที่เกี่ยวข้องกับ translation 1. mRNA 2. Activated amino acid 3. tRNA 4. Ribosome 5. Amino acyl-tRNA synthetase

บริเวณเชื่อมกับกรดอะมิโน ribothymine pseudouracil cytosine tRNA

การสร้าง aminoacyl-tRNA (Activated amino acid) ใช้ Aminoacyl-tRNA Synthetase

Aminoacyl-tRNA Anticodon ทำหน้าที่จดจำ genetic code บนเส้น mRNA

Genetic code on mRNA

ขั้นตอนการ translation Initiation Elongation Termination

1.Initiation mRNA ทุกโมเลกุลมี start และ stop signal จุดเริ่มต้น translation ในโปรคาริโอต มิได้เริ่มต้นที่ปลาย 5’ แต่มักเริ่ม ณ ตำแหน่งถัดเข้าไปประมาณ 25 nucleotide mRNA ของโปรคาริโอต เป็นแบบ polycistronic คือ mRNA 1 เส้นสามารถถอดรหัสได้โปรตีนมากกว่า 1 ชนิด

เริ่มต้นสังเคราะห์โดยใช้ formylmethionine (fMet) tRNAf Transformylase N10-formyltetrahydrofolate tRNA

Shine Dalgarno sequene (purine rich region)

formylmethionine (fMet) tRNAf จะเข้ามาจับที่ P site ของ Ribosome

2. Elongation Peptidyl transferase

3. Termination

การควบคุมการแสดงออกของยีน (Regulation of gene expression)

Central dogma

ยีนมีการแสดงออกเป็นโปรตีนโดยกระบวนการถอดรหัส เป็น mRNA การแสดงออกเป็นโปรตีนจำเป็นต้องมีการควบคุมที่เหมาะสม เพื่อมิให้มีการแสดงออกของยีนที่ไม่ต้องการ หรือมีการแสดงออกมากเกินไป อันเป็นผลเสียต่อสมดุลของเซลล์

จาก central dogma จะเห็นว่าสามารถควบคุมการแสดงออกได้หลายจุด เช่นตรงกระบวนการ transcription, translation แต่วิธีที่มีประสิทธิภาพที่สุดคือ การควบคุมในกระบวนการ transcription

ลักษณะของยีนที่นำไปสู่การควบคุมมี 3 ลักษณธ 1. Constitutive gene expression เป็นการแสดงออกของยีนต่อเนื่องตลอดเวลา โดยไม่ต้องมีสิ่งใดกระตุ้น บางครั้งเรียกอีกอย่างหนึ่งว่า housekepping gene 2. Inducible gene expression เป็นยีนที่แสดงออกเมื่อมีสิ่งมากระตุ้น (activator) 3. Repressive gene expression ยีนจะไม่แสดงออก เมื่อมีสารยับยั้ง (repressor)

การควบคุม initiation ของ transcription

การควบคุมแบบ operon ในโปรคาริโอต mRNA ส่วนใหญ่จะเป็น polycistronic mRNA มี promotor และ regulatory unit อยู่ร่วมกัน เรียกชุดของยีนเหล่านี้ว่า operon

operon Gene transcribed Regulatory sequence Activator binding site Repressor binding site Gene transcribed Gene A promoter Gene B Gene C Regulatory sequence

Lacoperon CAP=catabolite gene activator protein

ไม่มี glucose แต่มี lactose

มี glucose แต่ไม่มี lactose

Trp operon การควบคุมโดย repressor

Trp operon การควบคุมโดย attenuated mechanism