Pre-analytical and analytical Pitfalls in Coagulation Testing รองศาสตราจารย์ ทนพญ. ดร. นันทรัตน์ โฆมานะสิน คณะเทคนิคการแพทย์ มหาวิทยาลัยขอนแก่น การประชุมสัมมนา “Modern Coagulation: Moving Forward” วันที่ 13 กันยายน พ.ศ. 2561 ณ โรงแรมดุสิตธานีกระบี่ จังหวัดกระบี่ Komanasin N. 13092018

กับดัก หลุมพลาง อันตรายแอบแฝง https://play.google.com/store/apps/details?id=com.activision.pitfall กับดัก หลุมพลาง อันตรายแอบแฝง Prevent the quality of blood coagulation test results How to avoid ??????? Komanasin N. 13092018

Contents Overview in haemostasis Pre-analytical process and pitfalls Post-analytical process Case studies Komanasin N. 13092018

4 Komanasin N. 13092018

https://i.ytimg.com/vi/5GPPt0kftfE/maxresdefault.jpg Komanasin N. 13092018

Haemostatic balance Vessel Platelet Inhibitors Coagulation Fibrinolysis Haemostatic balance Komanasin N. 13092018

Bleeding Vessel Platelet Coagulation Inhibitors Fibrinolysis http://www.discoveryhealthjournal.com/2011/08/hematoma-definition-cause-and-treatment.html Komanasin N. 13092018

Thrombosis Inhibitors Fibrinolysis Vessel Platelet Coagulation http://www.netdoctor.co.uk/conditions/heart-and-blood/a1189/post-thrombotic-syndrome/ Komanasin N. 27062017

Platelet count, bleeding time, platelet function test WBCT, PT, APTT, TT, factor assay Inhibitor assay D-dimer https://i.ytimg.com/vi/5GPPt0kftfE/maxresdefault.jpg Komanasin N. 13092018

Tests and assays in haemostasis Routine tests Bleeding time Whole blood clotting time or VCT PT APTT TT Fibrinogen assay D-dimer Diagnostic tests Factor assay vWF assay Platelet function test Thrombophilia testing Factor inhibitors Komanasin N. 13092018

ประโยชน์ทางคลินิกของการทดสอบทางกระบวนการห้ามเลือด ตรวจคัดกรอง วินิจฉัย ประเมินความรุนแรง รักษาและติดตามการรักษา โรคที่เกิดจากความผิดปกติของการห้ามเลือด Komanasin N. 13092018

ผลการตรวจทางห้องปฏิบัติการต้องมีความถูกต้อง Internal quality control (IQC) External quality assurance (EQA) Identifying and correcting problems related to the errors of test results To ensure high quality of test results Correct diagnosis and interpretation Komanasin N. 13092018

Pre-analytical process Post-analytical process Patients Pre-analytical process Analytical process Post-analytical process Total testing process starts and ends with patients Komanasin N. 13092018

ความผิดพลาดที่เกิดขึ้นได้จากกระบวนการทดสอบ Pre-analytical errors (46-68%) Analytical errors (7-13%) Post-analytical errors (19-47%) Incorrect test request Test request lost Patient identification error Patient preparation error Mislabeling of the test tube Sample collection error Incorrect handling of sample Transport error -Sample lost Sample mix up Equipment failure Analytical error -Test result lost -Turn around time Transcription error Incorrect interpretation Komanasin N. 13092018 Carraro P, Plebani M. Errors in a stat laboratory: types and frequencies 10 years later. Clin Chem 2007 Jul;53(7):1338-42.

ผลของความผิดพลาดที่เกิดขึ้น Errors made in the period prior to the analysis of the sample ... may influence the quality of the final measured results ... Adverse consequence for diagnosis and treatment of the patient No result is better than bad result Komanasin N. 13092018

Pre-analytical process and its effect on coagulation testing Patient management Sample collection Sample transport Sample processing and storage Controlled thawing and frozen plasma samples Can we trust the samples ? Can we manage? Komanasin N. 13092018

Patient management การอดอาหารของผู้ป่วยก่อนการเจาะเลือด การได้รับยาที่มีผลต่อการทดสอบก่อนการเจาะเลือด เช่น heparin, wafarin, aspirin การงดพฤติกรรมบางอย่างที่มีผลต่อการทดสอบก่อนการเจาะเลือด Komanasin N. 13092018

Mode of action of heparin Prolonged PT, APTT Komanasin N. 13092018

Mode of action of wafarin Prolonged PT, APTT Komanasin N. 13092018

Mode of action of aspirin X Aspirin Komanasin N. 13092018 Smith, et al.,Williams Hematology, 2010

Patient and sample identification Proper patient and also sample identification Accurate verification of patient identity Label tube with the presence of patients Komanasin N. 13092018

Guidelines available from different committees Clinical and Laboratory Standard Institute (CLSI) Haemostasis and Thrombosis Task force of the British Committee for Standards in Haematology (BCSH) International Society of Thrombosis and Haemostasis (ISTH) etc. Komanasin N. 13092018

Recommendations for blood collection เจาะเลือดจากหลอดเลือดดำโดยให้เกิด stasis น้อยที่สุด ใช้เข็ม หรือ butterfly 19-21 G ในกรณีเด็กเล็กอาจใช้ 23 G ไม่ใช้เลือดจากสายที่กำลังให้เฮปาริน สารกันเลือดแข็งที่เหมาะสม 0.105 M-0.109 M (3.2%) tri-sodium citrate อัตราส่วนเลือด 9 ส่วน ต่อสารกันเลือดแข็ง 1 ส่วน หลอดเก็บเลือดเป็นพลาสติกหรือหลอดแก้วที่เคลือบด้วย silicone ผสมเลือดและสารกันเลือดแข็งให้เข้ากันทันที โดยกลับหลอดไปมา 5-6 ครั้ง ถ้า haematocrit > 55% ต้องปรับสัดส่วนของเลือดกับสารกันเลือดแข็ง Komanasin N. 13092018

Sample collection Prolonged using tourniquet > 3 min Blood stasis Increased intravascular pressure Haemoconcentration Shorten PT Komanasin N. 13092018

Sample collection < > Komanasin N. 13092018 Laboratory evaluation of hemostasis. In: Rodak’s Hematology Clinical, principles and applications. 5th ed, 2016

Sample collection Interference of Hb pigment with photo-optical system http://www.bestresumeguru.com/phlebotomy-resume-sample-breathe-taking Interference of Hb pigment with photo-optical system Komanasin N. 27062017

Sample collection Anticoagulant (3.2% or 3.8% tri-sodium citrate) Recommendation: 3.2% tri-sodium citrate ถ้าใช้ 3.8% Tri-sodium citrate overestimate the PT and APTT Komanasin N. 13092018

ลำดับการดูดเลือดใส่ในหลอดเก็บเลือดแบบต่าง ๆ เพื่อป้องกันการปนเปื้อนจากสารกันเลือดแข็วชนิดอื่น Komanasin N. 13092018

Sample collection Haemolysis Falsely shorten clotting time Inadequate volume (under-filling) Sample dilution Excess calcium-binding citrate Falsely prolonged clotting time Insufficient mixing Sample clots Too vigorous mixing or shaking of tube Haemolysis Falsely shorten clotting time Komanasin N. 13092018

Recommendations for specimen handling นำส่งเลือดอย่างรวดเร็ว เตรียม platelet poor plasma โดยปั่นที่ 1,500 g, 10-15 นาที ที่อุณหภูมิ 18-25oC เหลือเกล็ดเลือด < 10,000 /µl ตรวจสอบพลาสมาหลังการปั่น clot, haemolysis, icterus, lipaemia, proportion of plasma reject sample check haematocrit 30 Komanasin N. 13092018

Sample transport As short time as possible Extreme temperature should be avoid Delay transportation Prolong clotting time and loss of factor activities Komanasin N. 13092018

Sample processing and storage Centrifugation At 15-22 C° and 1,500 g for 10-15 minutes Centrifuge forces > 1,500 g and centrifuge break are not recommended กระตุ้นเกล็ดเลือด และทำให้เม็ดเลือดแดงแตก ทำให้เลือดกลับมาผสมกันอีกครั้ง Komanasin N. 13092018

After centrifugation Plasma √ Packed RBC Haematocrit (Hct) ของตัวอย่างมีผลต่ออัตราส่วนระหว่างเลือดกับสารกันเลือดแข็ง ถ้า Hct >55% หรือ < 20% จะต้องปรับปริมาณของสารกันเลือดแข็งใหม่ คำนวณจากสูตรของ CLSI guidelines H21-A5 C = (1.85 x 103)(100-Hct)(VBlood) C: volume of citrate remaining in the tube Hct: patient’s haematocrit V: volume of blood added (if a 5 ml tube is used, then the volume is 4.5 ml) 1.85x103: constant (citrate volume, blood volume, citrate concentration) Komanasin N. 13092018

Laboratory evaluation of hemostasis Laboratory evaluation of hemostasis. In: Rodak’s Hematology Clinical, principles and applications. 5th ed, 2016

Recommendations for plasma storage หากเก็บพลาสมาไว้ที่ 4oC ควรทำการทดสอบภายใน 4 ชั่วโมง หากจำเป็นต้องแช่แข็งพลาสมา ให้ใช้หลอดพลาสติกจุกเกลียว ที่มี ‘O’ ring เก็บที่ <-70oC แต่ถ้าเก็บที่ -20oC เก็บได้นานไม่เกิน 2 สัปดาห์ ก่อนใช้พลาสมาที่แช่แข็ง ให้ละลายที่ 37oC, 3-5 นาที (พลาสมา 1-2 ml) แล้วผสมให้เข้ากัน

- Laboratory evaluation of hemostasis. In: Rodak’s Hematology Clinical, principles and applications. 5th ed, 2016

สาเหตุสำคัญที่ทำให้เกิดสิ่งรบกวนการตรวจวัดในพลาสมา Spurious haemolysis (40%) Prevailing over pre-analysis clotting (29%) Inappropriate filling of primary blood collection tubes (28%) Lipaemia (13%) Hyperbilirubinemia (11%) Lipaemia and hyperbilirubinemia (both approximately 1%) 37 Lippi et. al. Seminars in Thrombosis & Hemostasis 2013

Haemolysis Haemolysis เป็นสาเหตุที่สำคัญที่สุดของการปฏิเสธสิ่งส่งตรวจในการตรวจการแข็งตัวของเลือด ในตรวจประจำวัน ประมาณ 95% ของ haemolysed เป็นแบบ slightly haemolysed C56-A—HIL indicies as indication of interference in clinical laboratory analysis; Approved Guideline

Causes of haemolysis blood samples Sample collection Poor venous access, inappropriate technique Traumatic venipuncture Use of needle of smaller size (> 23 gauge) Prolonged tourniquet placing Sample handling Excessive shaking of collection tubes

Sample transportation Excessive time before centrifugation Transport at extremes of temperature (too low/too high) Trauma and mechanical injury to the specimens Sample preparation Centrifugation at inappropriate force (too high), time (too long) and/or temperature (too low/too high) Transfer of plasma containing contaminating cell fractions followed by freezing and thawing before testing

Leading mechanisms causing haemolytic-related interference in coagulation testing Lippi et. al. Seminars in Thrombosis & Hemostasis 2013

Influence of haemolysis on coagulation testing Rob and Paar. Laboratoriumsmedizin 1998 Lippi et al. Arch Pathol Lab Med 2006 Lippi et al. Clin Chem Lab Med 2008 Haemolysed plasma affect APTT PT TT Fibrinogen and antithrombin levels D-dimer Woolley et al. Int Jnl Lab Hem 2016 APTT but not PT and fibrinogen is affected by haemolysis Haemolysed samples should be rejected

Icterus Hyperbilirubinemia is commonly defined as the presence of excess bilirubin concentration >1.5 mg/dL in the blood Interfere haemostasis testing Mostly attributable to spectral overlap Between 400-520 nm C56-A—HIL indicies as indication of interference in clinical laboratory analysis; Approved Guideline

Haemolysis, icterus and lipaemia (HIL) system Absorbance of potentially interfering substances [cell-free haemoglobin, hyperbilirubinemia and lipaemia (turbidity) Lippi et. al. Seminars in Thrombosis & Hemostasis 2013 2013

Influence of hyperbilirubinemia on coagulation testing Tantanate et al. Siriraj Medical Journal 2011 Using automated analyser (660 nm wavelength) Icteric plasma up to a final concentration of 14.07 mg/dL of free bilirubin and 14.55 mg/dL of conjugated bilirubin Icteric samples have no effect on PT, APTT and fibrinogen assay Woolley et al. Int Jnl Lab Hem 2016 Icteric plasma did not interfere the PT, APTT and fibrinogen levels

Error prevention According to the data presented hyperbilirubinemia does not represent a substantial analytical problem for the modern coagulometers, provided that a dedicated wavelength is used for analysis of visually icteric samples

Lipaemia “Turbid or lipaemic sample” Attribute to many diseases is typically caused by the presence of an excess of triglycerides (above 500 mg/dL) Attribute to many diseases Postpandial metabolism Metabolic disorder Chronic alcohol abuse Renal and thyroid diseases SLE C56-A—HIL indicies as indication of interference in clinical laboratory analysis; Approved Guideline

Influence of lipaemia on coagulation testing Rob and Paar. Laboratoriumsmedizin 1998 Lipaemia had no effect on PT and APTT But TT Antithrombin Fibrinogen Tantanate et al. Siriraj Medical Journal 2011 Lipaemia PT APTT Woolley et al. Int Jnl Lab Hem 2016 - Lipaemia did not interfere the PT, APTT and fibrinogen levels

Error prevention Remove excess triglycerides CLSI recommendations Remove excess triglycerides Ultracentrifugation for 30 mins at 40,000 g Double centrifugation for 15 mins at 20,000 g Using lipid-clearing agents such as lipoclear® or n-hexane The best approach might be recollection of blood samples at fasting

Haemolysis, icterus and lipaemia (HIL) system turbidity Hb bilirubin Absorbance of potentially interfering substances [cell-free haemoglobin, hyperbilirubinemia and lipaemia (turbidity)] Lippi et. al. Seminars in Thrombosis & Hemostasis 2013 2013

The interfering substances may impact assays differently depending on (i) the parameter (ii) the nature of the interfering substance (iii) the level of the interfering substance (iv) the specific reagent used to run an assay (v) the principle of instrument

Specimen Quality Markers for Rejection Incorrect labeling Unlabeled specimen Clotted Haemolysed Underfilled, overfilled Incorrect patient Incorrect specimen Contaminated Lost sample Broken and leaking

Haemostasis specimen collection errors that require collection of a new sample Modified from: Laboratory evaluation of hemostasis. In: Rodak’s Hematology Clinical, principles and applications. 5th ed, 2016

How to prevent the analytical errors? Analytical process How to prevent the analytical errors? Human resource Reagent Equipment / instrument IQC/EQA Reference range Validity

Instrument methodologies used for coagulation testing End-point detection Principle: Mechanical Photo-optical (turbidometric) Nephelometric Chromogenic (amidolytic) Immunologic

Advantage and disadvantage of detection system 56 Komanasin N. 27062017

Quality assurance Precision Accuracy Internal quality control (IQC) External quality assurance (EQA) Accuracy Identifying and correcting problems related to the errors of test results

Spanning the adult age range Mean + 2SD (normal distribution) Normal range or reference range > 30 healthy donors Both sexes Spanning the adult age range Mean + 2SD (normal distribution) 2.5 and 97.5 percentile (not normal distribution)

Factors that interfere with the validity of clotted-based results >

ความผิดพลาดที่จะมีผลต่อคุณภาพของผลการทดสอบ ใครบ้างที่มีส่วนเกี่ยวข้อง ? เกิดขึ้นในห้องปฏิบัติการ หรือนอกห้องปฏิบัติการ? จะทราบได้อย่างไรว่าจะเกิดความผิดพลาดได้? จะทราบได้อย่างไรว่ามีความผิดพลาดเกิดขึ้น? ความผิดพลาดที่เกิดขึ้นมีผลอย่างไรกับผลการทดสอบ? จะป้องกันและแก้ไขอย่างไร?

Post-analytical process Validation Reporting Interpretation

กรณีศึกษาที่ 1 ผู้ป่วยเด็กชายไทยอายุ 5 ขวบ มาพบแพทย์ที่ตึกอุบัติเหตุฉุกเฉิน ด้วยอาการหูอักเสบ และมีประวัติครอบครัวว่าน้าชายเสียชีวิตด้วยการมีเลือดออกในสมอง แพทย์ส่งตรวจ CBC และ PT & APTT CBC: Hb 20 g/dl, Hct 62%, WBC 12.0 x109/l PT 16 sec (9.9-11.9) , APTT 55 sec (27.0-38.0 sec) แพทย์ควรทำอะไรต่อ Mixing test Factor assay Lupus anticoagulant Repeat PT & APTT √

Pre-analytical variables: avoid “pitfalls” that prevent quality coagulation results, SIEMENS.

คิดว่าเกิดจากอะไร? และควรทำอะไรต่อ? กรณีศึกษาที่ 2 ผลการทดสอบ PT & APTT เป็นดังนี้ PT 12.3 sec (9.9-11.9 sec), APTT 79.9 sec (27.0-38.0 sec) แพทย์โทรกลับมาบอกว่า ผลที่ได้ เป็นไปไม่ได้ ขอให้ repeat ผล repeat เป็นดังนี้ PT 13.0 sec, APTT 81.0 sec คิดว่าเกิดจากอะไร? และควรทำอะไรต่อ? ถ้าทำการทดสอบ TT แล้วให้ผล prolonged จะแปลผลอย่างไร?

Pre-analytical variables: avoid “pitfalls” that prevent quality coagulation results, SIEMENS.

ทำไมค่า APTT จึงสั้นลง? กรณีศึกษาที่ 3 ผลการทดสอบ PT & APTT เป็นดังนี้ PT 10.7 sec (9.9-11.9 sec), APTT 48.0 sec (27.0-38.0 sec) เก็บพลาสมาไว้ที่ -70oC เพื่อรอทำการตรวจพิเศษหาสาเหตุของค่า APTT ที่ prolonged เมื่อนำพลาสมามาละลายแล้วทำการทดสอบ APTT อีกครั้ง ได้ผลดังนี้ APTT 37.0 sec ทำไมค่า APTT จึงสั้นลง? Pre-analytical variables: avoid “pitfalls” that prevent quality coagulation results, SIEMENS.

Pre-analytical variables: avoid “pitfalls” that prevent quality coagulation results, SIEMENS.

สาเหตุของความไม่สอดคล้องการตรวจครั้งที่ 1 และ 2 คือ? กรณีศึกษาที่ 4 ผู้ป่วยหญิงที่มีอาการเลือดออกผิดปกติ ตรวจ PT & APTT ที่ OPD lab ได้ผลดังนี้ PT 11.0 sec (9.9-11.9 sec), APTT 80.0 sec (27.0-38.0 sec) ส่งพลาสมาที่เหลือไปที่ห้องปฏิบัติการโลหิตวิทยาเพื่อทำ factor assay เมื่อตรวจ PT & APTT ซ้ำ ได้ผลดังนี้ PT 10.8 sec (9.9-11.9 sec), APTT 45.0 sec (27.0-38.0 sec) ผลที่ได้ไม่สอดคล้องกับการตรวจครั้งแรก จึงเจาะเลือดเพื่อตรวจซ้ำอีกครั้ง ได้ผลดังนี้ PT 10.9 sec (9.9-11.9 sec), APTT 94.0 sec (27.0-38.0 sec) สาเหตุของความไม่สอดคล้องการตรวจครั้งที่ 1 และ 2 คือ?

มีจำนวนเกล็ดเลือดเหลืออยู่มากกว่า 10,000/µl ถ้าการปั่นแยกพลาสมาครั้งแรกด้วยรอบปั่นที่ต่ำกว่าและหรือใช้เวลาน้อยกว่าที่กำหนด มีจำนวนเกล็ดเลือดเหลืออยู่มากกว่า 10,000/µl มี platelet fragment, microparticles ค่า APTT สั้นลง

กรณีศึกษาที่ 5 ณ โรงพยาบาลศูนย์แห่งหนึ่ง มีผู้ป่วย OPD จำนวนมากต่อวัน ได้ทำการเจาะเลือดผู้ป่วยรายหนึ่ง ส่งตรวจ PT ได้ผลดังนี้ PT = 60.9 sec (9.9-11.9 sec) ผลที่ได้ไม่สอดคล้องกับอาการทางคลินิกของผู้ป่วยเลย แพทย์จึงสั่งตรวจอีกครั้งหนึ่ง ได้ผลดังนี้ PT = 19.6 sec และเมื่อส่งตรวจซ้ำอีก 2 ครั้ง ก็ให้ผลสอดคล้องกับการตรวจครั้งหลัง Pre-analytical variables: avoid “pitfalls” that prevent quality coagulation results, SIEMENS.

Pre-analytical variables: avoid “pitfalls” that prevent quality coagulation results, SIEMENS.

Pre-analytical variables: avoid “pitfalls” that prevent quality coagulation results, SIEMENS.

The Brain-to-Brain Loop Concept for Laboratory Testing 40 Years After Its Introduction. Am J Clin Pathol. 2015;136(6):829-833. doi:10.1309/AJCPR28HWHSSDNON Komanasin N. 27062017

No result is better than bad result Thank you for your attention Komanasin N. 27062017