การตรวจยืนยันและการแปลผลตรวจ ธาลัสซีเมียและการระบุคู่เสี่ยง การตรวจยืนยันและการแปลผลตรวจ ธาลัสซีเมียและการระบุคู่เสี่ยง ปานทิพย์ ศิริโชติ ศูนย์วิทยาศาสตร์การแพทย์ที่ 5 สมุทรสงคราม

HEMOGLOBIN STRUCTURE

b / b aa / aa b b a1 a1 d a2 a2 Ag Gg Chromosome 11 Chromosome 16

การสร้างสายโกลบินในช่วงอายุต่างๆ Hb A ( a 2 b 2 ) 90% Hb F ( a 2 g 2 ) < 1.5 % Hb A2 ( a 2 d 2 )

ความผิดปกติของการสร้าง Hemoglobin : Globin chain ก. ลดลงหรือไม่สร้าง : ปริมาณ Hb ข. สร้างชนิดผิดปกติ (amino acid เปลี่ยนไป) : Variant Hb เช่น Hb E, Hb Cs ทั้ง 2 ข้อข้างต้น

a b a b a b a b ปกติ a Thal b Thal a+b Thal

-25 % -50% -75% -100% Alpha globin genotype Bart’s hydrops Normal a thal 2 a thal 1 H diseases Alpha globin genotype Chain Deletion

3. Bart’s hydrops fetalis กระทรวงสาธารณะสุขต้องการวางระบบการตรวจวินิจฉัย เพื่อป้องกันThalassemia ชนิดรุนแรง 3 ชนิดของ ได้แก่ 1. Homozygus b0 Thalassemia (b0 / b0 ) 2. b0 thal /HbE 3. Bart’s hydrops fetalis (a-thal1 / a-thal1 )

การแปลผล : Retention time (RT) รูปแบบ และ%พื้นที่ใต้กราฟ RT : ระยะเวลาการเดินทางของ Sample ตั้งแต่เริ่มต้น (ฉีด) ถึงจุดสูงสุดของ elution peak ชนิดของ Hb LPLC (sec) HPLC (sec) Bart’s 0-45 ไม่อ่าน RT F1 , H 45-60 H F 110-140 1.14 A0 195-235 2.4 E 250-274 3.65 A2 275-290 D 290-300 S 4.5 320-340 CS 4.9 290-340 C 5 340-400 5.2

Quality Assurance of Hb typing Pre analytical : Analytical Calibrator : %Hb F, %Hb A2 Internal Quality Control: control chart plot of normal level, high level (%Hb F, %Hb A2) Instrument Maintainance: ประจำวัน และรอบ 6 เดือน Chromatogram : RT,area ใต้กราฟ, base line, การแปลผล EQAS : Bio-rad, ศวก.ที่ 1 Post analytical :

Genotype b / b MCV<80 ตรวจ a –thal 1 DNA ผล CBC ที่ดูประกอบ %Hb F = 0.0 %Hb A2 = 2.5 Hb-typing : A2A MCV > 90 pg , RDW/CV 12 – 16 แปลผล : Normal typing MCV > 80 pg , RDW/CV < 16   แปลผล : Normal typing (but alpha-thal2 trait not exclude) MCV < 80 pg แปลผล : Normal typing (but alpha-thal trait not exclude) Genotype b / b MCV<80 ตรวจ a –thal 1 DNA

ตารางแสดงผลทางโลหิตวิทยาในพาหะธาลัสซีเมียและคนปกติ

Genotype b / b 0 %Hb F = 0.9 % Hb A2 = 6.0 Hb-typing : A2A(High A2) แปลผล : : beta thal trait Genotype b / b 0 หรือ b / b + ตรวจ b –mutation DNA ตรวจ a –thal 1 DNA

Genotype b / b E แปลผล : Hb E trait %Hb F = 0.7 % Hb E = 26.2 Hb-typing : EA แปลผล : Hb E trait หมายเหตุ : % E > 25 %Always not have a thal 1 included Genotype b / b E กรณี EA , %HbE>25 ที่คู่สมรส เป็น Hb typing ชนิดใดก็ตามจะ ไม่ตรวจ a –Thal1 DNA

Always have a thal disease included Hb E + Hemoglobin H disease ( b E / b + a thal 1/a thal 2 ) % E < 20 % Always have a thal disease included

Genotype b / b E แปลผล : Hb E trait(Prob with a thal 1 ) %Hb F = 2.6 Hb-typing : EA แปลผล : Hb E trait(Prob with a thal 1 ) Hb E Trait ที่%HbE<25 Genotype b / b E ตรวจ a –thal 1 DNA

Genotype b E / b E %Hb F = 1.4 % Hb E = 84.0 Hb-typing : EE แปลผล : Homozygous Hb E Genotype b E / b E ตรวจ a –thal 1 DNA

Genotype b / b E Genotype a-thal1 / acs %Hb Bart’s Present %Hb F = 2.2 % Hb E = 14.7 %Hb CS = 2.6 Hb-typing : CSEABart’s แปลผล : EA Bart’s diseases with Hb CS Genotype b / b E Genotype a-thal1 / acs

Genotype b / b %Hb Bart’s H Present %Hb F = 0.4 % Hb A2 = 1.5 Hb-typing : A2ABart’s H แปลผล : Hemoglobin H disease Genotype b / b a-Thal1 / a-Thal2

Genotype b+ / b E ตรวจ a –thal 1 DNA %Hb A = 33.5 %HbF= 50.8 % Hb E= 14.0 Hb-typing : EFA แปลผล : beta thal /Hb E Genotype b+ / b E ตรวจ a –thal 1 DNA

Genotype acs / acs b / b ตรวจ a –thal 1 DNA %Hb F= 0.8 % Hb A2= 2.4 %Hb CS = 6.6 Hb-typing : CSA2A แปลผล : Hb Cs Homozygous Genotype b / b acs / acs ตรวจ a –thal 1 DNA

แปลผล : Hb Bart's hydrop fetalis %Hb F= 0.0 % Hb A2= 0.0 %Hb Bart's : 100% Hb-typing : Bart's แปลผล : Hb Bart's hydrop fetalis a-Thal1 / a-Thal1

(คู่เสี่ยง b0 thal ตรวจ Beta mutation) HbA2/E (%) Hb F (%) HbTyping MCV RDW การแปลผล A2  4 < 8 A2A < 80   Normal typing (but alpha-thal trait not exclude) (ตรวจ DNA a-thal1) 80 Normal typing (but alpha-thal2 trait not exclude) 90 < 16 Normal typing A2 > 4 A2A (high A2) / b+ or b / b0 beta thal trait (คู่เสี่ยง b0 thal ตรวจ Beta mutation) E > 25 EA Hb E trait E  25 Hb E trait (probable with alpha-thal1 trait) E = 35 – 80 11.5±6.7 48.4±12.7 EFA EF(A) b+ / bE Beta (+) and Hb E Severe Beta(+) and Hb E E > 75 < 10 EE Homozygous HbE

Hb CS trait or Homozygous Hb Cs A2 ใดๆ > 10 A2FA b0 / b+ b+/ b+ HbA2/E (%) Hb F (%) HbTyping การแปลผล E = 10 – 20, พบ Bart’s < 8 EABart’s EABart’s disease (ตรวจ DNA a-thal1) E  40 ,พบ Bart’s > 10 EFBart’s bE / bE b0 / bE EFBart’s disease (ตรวจ Beta mutation) A2 < 4 , พบ Bart’s H A2ABart’sH Hb H disease A2 < 4 พบ CS และ Bart’s H CSA2A Bart’sH Hb H disease with Hb CS A2 < 3.5 และพบ CS Hb CS trait or Homozygous Hb Cs A2 ใดๆ > 10 A2FA b0 / b+ b+/ b+ Heterozygous beta(0) and beta (+) or beta(+) and beta (+) A2  4 > 80 A2F b0 / b0 Homozygous beta (0) or Heterzygous severe beta(+)

Heterozygouse : HbE + Hb Korle-Bu Heterozygouse : HbE + Hb Dhonburi Unknown Abnormal Hb Heterozygouse : HbE + Hb Korle-Bu Heterozygouse : HbE + Hb Dhonburi

RT of Hb Variant Normal Hb A (2.35) F (1.14) A2 (3.65) Cs (4.95) Pakse J Bangkok(1.14) Hekinan H Dhonburi Malay Tak (4.25) D Punjab (4.15) S (4.35) Montgomery Q-Mahidol Bart’s New York Hope Pyrgos Kodaira E Lepore D-Iran Hb Variant Korle-Bu (3.8)

โดยเทคนิค Relative Quantitative PCR การตรวจวินิจฉัย a-Thalassemia 1 โดยเทคนิค Relative Quantitative PCR

a - thalassemia gene in Thailand z 2 yz 1 yz 2 ya 1 q 1 Inter z HVR HVR 5 ’ 3 ’ x y z x y z 3.7 kb deletion a - thalassemia 2 4.2 kb deletion SEA deletion ( > 17.5 kb) a - thalassemia 1 THAI deletion ( ~ 30 kb) รูปที่ 2 ภาพกลุ่มยีนอัลฟาโกลบิน แสดงตำแหน่งของ homology box X, Y และ Z และลักษณะของ DNA deletion ที่ทำให้เกิดอัลฟาธาลัสซีเมียที่มีรายงานตรวจพบในคนไทย SGF.-

Real time PCR วิธี Hydrolysis probe (Taqman) Primer-Probe: Normal Alpha globin gene (FAM) Primer-Probe: SEA Alpha globin gene (NED) Primer-Probe: Thai Alpha globin gene (VIC)

ขั้นตอนการตรวจ a-Thalassemia 1 โดยเทคนิค Relative Quantitative PCR เติม DNA ใส่ในสารผสมสำหรับ PCR สกัด DNA จาก EDTA blood เตรียมสารผสมสำหรับ PCR แปลผลร่วมกับ Hb typing วิเคราะห์ผลที่ได้จาก Real time PCR Real time PCR

Family 1 OF - / DCIP - Hb 14.4 g/dL OF - / DCIP - Hct 43.8 % MCV 85.2 fl MCH 28.0 pg MCHC 32.9 g/dl RDW - % Hb typing A2A Hb A2 2.6 % Hb F 1.0 % OF - / DCIP - Hb 11.4 g/dL Hct 33.2 % MCV 88.5 fl MCH 30.4 pg MCHC 34.3 g/dl RDW - % Hb typing A2A Hb A2 2.8 % Hb F 1.2 % PND ?

E a2? E Family 2 a1? OF - / DCIP - OF + / DCIP + Hb 15.3 g/dL Hct 43 % MCV 88.7 fl MCH 31.3 pg MCHC 35.2 g/dl RDW - % Hb typing A2A Hb A2 2.6 % Hb F 3.2 % OF + / DCIP + Hb 12 g/dL Hct 35 % MCV 61.6 fl MCH 21.2 pg MCHC 29 g/dl RDW - % Hb typing EE Hb E 79.8 % Hb F 3.4 % E a2? a1? E PND ?

a1? E a1? Family 3 OF + / DCIP - OF + / DCIP + Hb 12.5 g/dL Hct 42.8 % MCV 68.5 fl MCH 22.9 pg MCHC 33.4 g/dl RDW 12.9 % Hb typing EA Hb E 21.9 % Hb F 0.7 % OF + / DCIP - Hb 12.5 g/dL Hct 37.6 % MCV 64.8 fl MCH 21.6 pg MCHC 33.2 g/dl RDW 15.6 % Hb typing A2A Hb A2 2.5 % Hb F - % a1? E a1? PND ?

a1 a2 a1 a2 Family 4 OF + / DCIP - OF + / DCIP - Hb 10.6 g/dL Hct 36.1 % MCV 65.4 fl MCH 19.2 pg MCHC 29.4 g/dl RDW 24.9 % Hb typing A2AH Hb A2 2.5 % Hb F 1.0 % OF + / DCIP - Hb 8.5 g/dL Hct 28.1 % MCV 59.2 fl MCH 17.9 pg MCHC 30.2 g/dl RDW 27.9 % Hb typing A2A(Bart’s)H Hb A2 2.0 % Hb F 1.2 % a1 a2 a1 a2 PND ?

a1 a2 a1 a2 Family 5 OF + / DCIP - Hb 13.7 g/dL Hct 42 % MCV 68.1 fl MCH 22.5 pg MCHC 33.0 g/dl RDW 14.3 % Hb typing A2A Hb A2 2.1 % Hb F 0.6 % OF + / DCIP - Hb 12.1 g/dL Hct 37.4 % MCV 82.2 fl MCH 26.6 pg MCHC 32.4 g/dl RDW 13.1 % Hb typing A2A Hb A2 3.2 % Hb F 0.8 % a1 a2 OF + / DCIP - Hb 9.7 g/dL Hct 32.4 % MCV 59.7 fl MCH 17.9 pg MCHC 29.9 g/dl RDW 22.0 % Hb typing A2AH Hb A2 1.8 % Hb F 0.5 % a1 a2 PND ?

Family 6 b+ b0 b0 b+ OF + / DCIP - Hb 13.6 g/dL Hct 39.6 % MCV 66.8 fl MCH 22.9 pg MCHC 34.3 g/dl RDW - % Hb typing A2A Hb A2 6.8 % Hb F 1.2 % OF + / DCIP - Hb 10.6 g/dL Hct 30.7 % MCV 68. fl MCH 23.6 pg MCHC 34.5 g/dl RDW - % Hb typing A2A Hb A2 5.1 % Hb F 0.8 % b+ b0 OF + / DCIP - Hb 7 g/dL Hct 21.4 % MCV 75.0 fl MCH 25.7 pg MCHC 32.7 g/dl RDW - % Hb typing A2FA Hb A2 7.7 % Hb F nd % b0 b+ PND ?

Family 7 b0 E E b0 E a1? a1? OF + / DCIP + Hb 14.7 g/dL Hct 42 % MCV 60.8 fl MCH 21.4 pg MCHC 35.2 g/dl RDW - % Hb typing EE Hb E 83.7 % Hb F 2.2 % OF + / DCIP - Hb 10.5 g/dL Hct 32 % MCV 64 fl MCH 21.3 pg MCHC 33.2 g/dl RDW - % Hb typing A2A Hb A2 4.5 % Hb F 3.1 % b0 a1? E a1? E OF + / DCIP + Hb 6.7 g/dL Hct 22 % MCV 61.9 fl MCH 19.2 pg MCHC 31.0 g/dl RDW - % Hb typing EF Hb E 43 % Hb F 35 % b0 E PND ?

ถ้ามี มี หรือ อาจมี gene Hb A b Hb F > 10% b0 หรือ b+ Hb A2 > 3.5 Hb E bE Hb Bart’s ,Hb H , Barts’H a-thal 1

ไม่มี gene Alpha thal1 แน่นอน Hb typing MCV A2A >80 EA %HbE > 25

ขอขอบคุณ บริษัท พีซีแอลโฮลดิ้งจำกัด ผู้สนับสนุนรูปสไลด์บางส่วน

เพราะว่าพระเจ้าทรงรักโลกจนได้ทรงประทานพระบุตรองค์เดียวของพระองค์ เพื่อทุกคนที่วางใจในพระบุตรนั้นจะไม่พินาศ แต่มีชีวิตนิรันดร์ (ยอห์น 3:16) คำยำเกรงพระเจ้าเป็นบ่อเกิดของความรู้ คนโง่ย่อมดูหมิ่นปัญญาและคำสั่งสอน (สุภาษิต 1:7)