Propagation and Maintenance ดร. ยิ่งมณี ตระกูลพัว

การเพาะเลี้ยงไวรัสที่ก่อโรคในคน สัตว์ 1. สัตว์ทดลอง หนู กระต่าย ลิง - ฉีดเชื้อเข้าทางช่องท้อง, สมอง, ใต้ผิวหนัง - หยอดทางจมูก

Suckling Mice อายุ 3 วัน

การเพาะลี้ยงในสัตว์ทดลองควบคุมการแพร่กระจายได้ยาก แต่ไวรัสบางชนิดจำเป็นต้องใช้สัตว์ทดลอง - ดูพยาธิสภาพในหนู ex. Coxsackie virus A, B CAV เกิด Flaccid paralysis CBV เกิด Spastic paralysis - ไม่สามารถใช้ host ชนิดอื่นได้ ex. การเพาะเลี้ยง Hepatitis B ในลิง

CBV เกิด Spastic paralysis

การเก็บเชื้อไวรัสจากสัตว์ทดลอง

การเก็บเชื้อไวรัสจากการเพาะเลี้ยงในสมองหนู บดสมอง + อาหารเลี้ยงเซลล์ ปั่นแยก, ทิ้งเซลล์สมอง ที่ 4 องศาเซลเซียส เก็บไวรัสใน supernate ที่ -70 องศาเซลเซียส

2. ไข่ฟัก อายุระหว่าง 10-14 วัน ไวรัสสามารถเจริญได้ในส่วนต่างๆของไข่ฟัก -ถุงหล่อตัวอ่อน (amniotic sac) -ถุงหล่อรก (allantoic sac) -ถุงไข่แดง (yolk sac) -บริเวณ chorioallantoic membrane

Virus inoculation chorioallantoic membrane amniotic sac yolk sac allantoic sac

ช่องทางฉีดเชื้อไวรัส เชื้อไวรัส Aminotic, Allantoic sac Influenza, mump virus Yolk sac Herpes simplex virus Chorioallantoic membrane HSV,Small pox

Virus inoculation

เก็บไวรัสจาก Allantoic sac

การเพาะเลี้ยงไวรัสบริเวณ Chorioallantoic membrane เตรียม artificial air sac เก็บ Chorioallantoic membrane ที่ติดเชื้อไวรัส

Pock บริเวณ Chorioallantoic membrane HSV pock Vaccinia pock Pock: จุดสีขาวของกลุ่มเซลล์ติดเชื้อ

3. เซลล์เพาะเลี้ยง เพาะเลี้ยงไวรัส เตรียมวัคซีน เตรียมแอนติเจน 3. เซลล์เพาะเลี้ยง เพาะเลี้ยงไวรัส เตรียมวัคซีน เตรียมแอนติเจน ศึกษาฤทธิ์ของยาต้านไวรัส และกลไกการก่อโรค

เซลล์เพาะเลี้ยง Primary cell line Diploid cell line Continuous cell line

1. Primary cell line เช่น ไต ปอด ผิวหนัง กล้ามเนื้อ - fibroblast cell เตรียมได้เป็นครั้งแรกจากอวัยวะคน หรือสัตว์ เช่น ไต ปอด ผิวหนัง กล้ามเนื้อ - fibroblast cell - epithelial cell ข้อดี - ความไวในการแยกเชื้อสูง (รูปร่าง, โครโมโซมเหมือนอวัยวะต้นกำเนิด) ข้อเสีย - ชิ้นส่วนของอวัยวะมักตายหลัง subculture - ติดเชื้อไวรัสแฝงในเซลล์

2. Diploid cell line ต้นกำเนิดจาก primary cell line ex. MRC-5 (Medical Research Council 5) จาก Human embryonic lung ข้อดี - ความไวในการแยกเชื้อสูง - ทราบแน่นอนว่าไม่ก่อมะเร็ง ไม่มีไวรัสแฝง จึงเหมาะกับการใช้เตรียมวัคซีน ข้อเสีย- subculture 50-100 ครั้งเซลล์จะตาย

3. Continuous cell line ต้นกำเนิดจากการเปลี่ยนแปลงเป็นเซลล์มะเร็วของ diploid cell line ex. HeLa cell จากเซลล์มะเร็งปากมดลูก BHK-21 cell จาก baby hamster kidney ข้อดี - subculture ได้หลายร้อยครั้ง ข้อเสีย- คุณสมบัติเปลี่ยนไปมากทำให้ความไวในการแยกเชื้อ ลดลง - คุณสมบัติเป็นเซลล์มะเร็ง จีงไม่นิยมนำมาเตรียม ไวรัสเพื่อผลิตวัคซีน

การเพาะเลี้ยงเซลล์ อาหารเลี้ยงเซลล์ – กรดอะมิโน, วิตามิน, เกลือแร่, buffer, indicator (phenol red) ยาปฏิชีวนะ (penicillin, streptomycin) ยาฆ่าเชื้อรา (amphotericinB หรือ fungizone) growth factor (calf serum, epidermal growth factor) เซลล์ – monolayer, suspension

ภาชนะสำหรับเลี้ยงเซลล์ เลี้ยงเซลล์ในขวดแก้ว, ขวดพลาสติก, petri dish, test tube ในภาวะที่มีคาร์บอนไดออกไซด์ 5-10 % ภาชนะสำหรับเลี้ยงเซลล์

Subculture monolayer cell โดยใช้ proteolytic enzyme: trypsin, collagenase สามารถเก็บเซลล์ไว้ได้นานใน freezing medium: อาหารเลี้ยงเซลล์ + glycerol/ dimethyl sulfoxide Chinese Hamster Ovary Cell Culture

การเก็บเชื้อไวรัสจากเซลล์เพาะเลี้ยง เก็บจากอาหารเลี้ยงเซลล์ (extracellular virus) เก็บ infected cell เติมอาหารเลี้ยงเซลล์ ทำให้เซลล์แตกโดย freeze-thaw ปั่นแยก, ทิ้งเซลล์ ที่ 4 องศาเซลเซียส เก็บไวรัสใน supernate (intracellular virus) ไว้ที่ -70 องศาเซลเซียส หรือในไนโตรเจนเหลว (-196 องศาเซลเซียส )