Capillary Zone Electrophoresis (CZE) Introduction Capillary Zone Electrophoresis (CZE)

Introduction Capillary Gel Electrophoresis (CGE) Replaceable Gel DNA separate by size

เดิม : ใช้วิธีเตรียมเจลโดยใช้แผ่นกระจก Introduction Sequencing Process Analysis เดิม : ใช้วิธีเตรียมเจลโดยใช้แผ่นกระจก repeat for 2 batch of 48 Denature Casting Plate Check Pre-run Load Sample Separate/ Detect Tracking Analyze Database Interaction Beckman Coulter CEQTM 8000 Genetic Analysis System Denature Detect Load Sample Analyze Database Interaction Facilitated By Capillary Electrophoresis Technology

ไม่ต้องใช้ Glass Plates Introduction Advantages of CE in Genetic Analysis ไม่ต้องใช้ Glass Plates Separation gel เป็นแบบพร้อมใช้ (Linear polymer) ใช้เวลาในการแยกน้อย ทำการวิเคราะห์ได้อย่างรวดเร็ว ประหยัด DNA samples Dyes ที่ใช้มีความคงตัวสูง ระบบการทำงานเป็นแบบ FULL AUTOMATION !

CEQTM 8000 Systematic Layout Gel Fill Waste 8 Capillary-Array Detector 650nm laser 750nm laser Waste Gel Fill 8 Capillary-Array Detector

CEQTM 8000 Instrument Automatic Process Manifold Purging Capillary Purging Temperature Ramping Sample Denaturation Optical Alignment Sample Injection Sample Separation Data analyzing

CEQTM 8000 Dye Chemistry Specialized WellRed Dye Excite in the red and near IR region of spectrum Prone to Interference from biological materials NO Interference 650nm laser 750nm

เลเซอร์แต่ละตัวรับประกัน 5 ปี CEQTM 8000 Optical Detection 2 diode lasers : 650 nm & 750 nm มีอายุการใช้งานยาวนาน > 10,000 hrs ค่าใช้จ่ายในการดูแลรักษาต่ำ ก่อให้เกิดความร้อนน้อย Each laser excite 2 dyes : ลดปัญหาการเหลื่อมซ้อนของสัญญาณและเพิ่มความแม่นยำในการอ่านค่า เลเซอร์แต่ละตัวรับประกัน 5 ปี สามารถทำ Optical alignment ได้โดยอัตโนมัติก่อนเริ่มการวิเคราะห์แต่ละครั้ง

CEQTM 8000 ddN Abs (nm) Em (nm) ddT 649 675 (Cy5) ddG 682 708 (DBCy5) Dye Absorbance/Emission Wavelength ddN Abs (nm) Em (nm) ddT 649 675 (Cy5) ddG 682 708 (DBCy5) ddC 750 782 (Cy7) ddA 784 815 (DBCy7)

CEQTM 8000 Applications Sequencing Fragment Analysis De Novo Sequencing Confirmatory Sequencing Fragment Analysis STR / VNTR / SSR / Microsatellite Analysis AFLP Analysis for Fast Genome Mapping Multiplex SNP Scoring Loss of Heterozygosity (LOH) / Microsatellite Instability Peak Ratio Calculation / Quantitation

Sequencing Applications CEQTM 8000 Applications Sequencing Applications on CEQTM 8000

Sanger Sequencing method Introduction Sanger Sequencing method 3’-OH in normal DNA allows elongation. Dideoxynucleotide cannot be elongated. TGGCATA A C C G T A T Go to be separated into Capillary Electrophoresis

Sequencing Quality Values

Sequencing Results Poly A Poly T Poly C CA Repeats

Sequencing Results TG Repeats TC Repeats GA Repeats Complicated Repeats Regions

Sequencing Automatic Heterozygote Detection Sequence 1: ===GTAGGTGGACAGATAACAGAAGC=== Sequence 1: ===GTAGGAGGACAGCTAAAAGAAGC=== Sequence 2:

Fragment Analysis on CEQTM 8000

Fragment Analysis Applications Fragment Analysis STR / VNTR / Microsatellite Analysis AFLP Analysis for Fast Genome Mapping Multiplex SNP Scoring Loss of Heterozygosity (LOH) / Microsatellite Instability Peak Ratio Calculation / Quantitation Gene Expression Profiling

Fragment Analysis STR (VNTR) – What Is It ? Minisatellites: 9 - 80 bp repeats (Variable number tandem repeats -VNTR) Microsatellites: 2 – 7 bp repeats (Short Tandem Repeats – STR)

Fragment Analysis STR – How it Work PCR PCR CE CE Allele 1 - first chromosome Allele 2 - second chromosome 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 PCR PCR CE CE

Fragment Analysis AFLP Fragment Data

Fragment Analysis AFLP Fingerprinting

Fragment Analysis Manual Scoring vs CEQ 8000 Dominant Scoring Estimated Time Needed to Analyze 100 Samples 40 Hours Manual Scoring Analyzed AFLP Sample Data Record Fragments for Each Sample on Microsoft Excel Spreadsheet Clustering of Fragments with the Same Sizes from All Samples Convert to Binary 1/0 Data Using AFLP Analysis in CEQ 5.0 Software Analyzed AFLP Sample Data Run CEQ AFLP Analysis Exportable Binary 1/0 Data < 2 minutes

Fragment Analysis AFLP Applications Plant Molecular Genetics : Breeding Variety Identification Germplasm Management Agronomically Important Traits Selection Phylogeny & Diversity Study Evolution Geographic Orgins Animal Molecular Genetics : Gene Mapping (with STR) Diversity Microbial Genetics : Population Genetic Analysis Strain Typing Epidemiological Study Evolutionary Study Taxonomy Ecology Other Applications : Differential Gene Expression Functional Genomics