กล้องจุลทรรศน์และการย้อมสี ผศ.ดร.ปิยะนุช เนียมทรัพย์ คณะวิทยาศาสตร์ มหาวิทยาลัยแม่โจ้

การวัดขนาดจุลินทรีย์ เนื่องจากจุลินทรีย์เป็นสิ่งมีชีวิตขนาดเล็กที่ไม่สามารถมองเห็นได้ด้วยตาเปล่า ดังนั้นจึงต้องอาศัยกล้องจุลทรรศน์ (microscope) ซึ่งจะช่วยขยายให้มองเห็นรายละเอียดทั้งรูปร่างและลักษณะของเซลล์ หน่วยใช้วัดขนาดของจุลินทรีย์ เช่น ไมครอนหรือไมโครเมตร (micron, micrometer หรือ m), นาโนเมตร (nanometer, nm) และแองสตรอม (angstrom, oA) 1 micrometer (m) = 10-3 millimeter = 10-6 meter 1 nanometer = 10-9 meter 1 angstrom (oA) = 10-10 meter

กล้องจุลทรรศน์ (Microscope) กล้องจุลทรรศน์ แบ่งออกเป็น 2 ประเภท คือ แบบใช้แสงธรรมดาและแบบใช้แสงอิเล็กตรอน กล้องที่ใช้แสงธรรมดา (Light microscope) หรือเรียกว่ากล้องจุลทรรศน์เลนส์ประกอบ (compound microscope) เนื่องจากมีเลนส์ 2 ชุด คือ เลนส์วัตถุ (objective lens) และเลนส์ตา (ocular lens หรือ eyepieces) ใช้แสงธรรมดาเป็น แหล่งกำเนิดแสง ขยายภาพโดยแสงเดินทางจาก แหล่งกำเนิดแสงผ่านเลนส์รวมแสง (condenser lens) ซึ่งจะบังคับให้แสงตรงเข้าสู่วัตถุที่ต้องการดู ภาพของวัตถุจะถูกขยายอีกครั้งหนึ่งด้วยเลนส์ตา

กล้องที่ใช้แสงธรรมดา (Light microscope) แบ่งออกเป็น 1.1 กล้องจุลทรรศน์แบบไบรท์ฟิลด์ (bright field microscope) 1.2 กล้องจุลทรรศน์แบบดาร์คฟิลด์ (dark field microscope) 1.3 กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงอัลตราไวโอเลต (ultraviolet microscope) 1.4 กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์ (fluorescence microscope) 1.5 กล้องจุลทรรศน์เฟสคอนทรัสต์ (phase-contrast microscope)

1.1 กล้องจุลทรรศน์แบบไบรท์ฟิลด์ (bright field microscope) เป็นกล้องจุลทรรศน์ที่ใช้กันอย่างแพร่หลายในห้องปฏิบัติการทั่วไป มีกำลังขยายประมาณ 1,000 เท่า ข้อจำกัดของกำลังขยาย (magnification) นี้ไม่ได้ขึ้นอยู่กับผลคูณของกำลังขยายของเลนส์ตาและเลนส์วัตถุเท่านั้น แต่ยังขึ้นกับความสามารถของเลนส์วัตถุในการแยกแยะรายละเอียดของภาพ ให้เห็นความแตกต่างกันได้ ที่เรียกว่ารีซอลวิงเพาเวอร์ (resolving power)

ค่า resolving power หรือค่ารีโซลูชัน (resolution) หมายถึง ค่าความสามารถของเลนส์ในการแยกแยะรายละเอียดของภาพ ทำให้เห็นความแตกต่างระหว่างจุดสองจุดที่อยู่ภายในโครงสร้างได้ ค่า resolving power ขึ้นอยู่กับความยาวคลื่นแสง และค่า numerical aperture, N.A.) ของเลนส์นั้น ค่า resolving power = ความยาวคลื่นแสง 2 N.A. ดังนั้น ถ้าความยาวคลื่นแสงยิ่งสั้น จะให้รายละเอียดของภาพมากขึ้น Numerical aperture (N.A.) เป็นสมบัติของเลนส์ที่เกี่ยวข้องกับดัชนีหักเหของตัวกลางที่แสงผ่านไปก่อนจะเข้าสู่เลนส์วัตถุ

เลนส์วัตถุที่ใช้น้ำมัน (oil immersion objective) เป็นเลนส์วัตถุที่มีกำลังขยายมากที่สุด คือ 100 เท่า ซึ่งการใช้เลนส์นี้ต้องเพิ่มความระมัดระวังมาก เนื่องจากระยะห่างระหว่างวัตถุกับเลนส์ชิดกันมาก เวลาใช้จึงต้องหยดน้ำมัน (immersion oil) บนสไลด์และให้เลนส์วัตถุสัมผัสกับน้ำมัน เพื่อให้แสงเดินทางผ่านเป็นเส้นตรงเข้าสู่เลนส์วัตถุได้ ถ้าไม่ใช้น้ำมัน แสงที่ผ่านจากแก้วสไลด์เข้าสู่อากาศ จะหักเหออกไปมากทำให้แสงเข้าสู่เลนส์น้อย ภาพจึงไม่ชัด

กำลังขยายของกล้องจุลทรรศน์ (magnification) กล้องส่วนใหญ่ที่ใช้ในห้องปฏิบัติการจุลชีววิทยา ประกอบด้วยเลนส์วัตถุ 4 ขนาด ซึ่งมีกำลังขยายที่ต่างกัน คือ - เลนส์วัตถุกำลังขยายต่ำ (low-power objective lens) = 4x, 10x - เลนส์วัตถุกำลังขยายสูง (high-power objective lens) = 40x - เลนส์วัตถุหัวน้ำมัน (oil immersion objective lens) = 100x ขณะที่เลนส์ตามีกำลังขยาย 10 เท่า ดังนั้น กำลังขยายของภาพจากกล้องจุลทรรศน์จึงสามารถคำนวณได้จาก กำลังขยายของภาพ = กำลังขยายของเลนส์ตา x กำลังขยายของเลนส์วัตถุ

1.2 กล้องจุลทรรศน์แบบดาร์คฟิลด์ (dark field microscope) เป็นกล้องจุลทรรศน์ที่ทำให้พื้นภาพเป็นสีดำ ในขณะที่วัตถุที่ต้องการดูเกิดภาพสว่าง โดยอาศัย condenser พิเศษ (dark field stop) ที่จะตัดแสงออกไปไม่ให้เข้ากล้อง ดังนั้นถ้าพื้นของตัวอย่างที่จะศึกษาเป็นสารเนื้อเดียวกันและโปร่งใส แสงที่ผ่าน condenser พิเศษนี้จะเลยออกไปและพื้นภาพจะเป็นสีดำ แต่ถ้ามีวัตถุอยู่จะเกิดการสะท้อนและหักเหแสงให้เข้าสู่เลนส์ จึงเกิดภาพสว่างขึ้นในที่มืด กล้องนี้มี ประโยชน์ใช้ศึกษาจุลินทรีย์ที่ไม่ย้อมสีและ ศึกษาสไลด์สดและเทคนิคหยดแขวน และใช้ในการวินิจฉัย เชื้อโรคบางชนิด เช่น เชื้อซิฟิลิส

1.3 กล้องจุลทรรศน์อัลตราไวโอเลต (ultraviolet microscope) เป็นกล้องจุลทรรศน์ที่ใช้แสงอัลตราไวโอเลต ซึ่งจะทำให้ resolving power มากกว่ากล้องธรรมดา เพราะแสงอัลตราไวโอเลตมีคลื่นสั้นกว่า (ประมาณ 180-400 nm) เลนส์ของกล้องชนิดนี้ทำจากควอตซ์ ทำให้แสงเข้าสู่กล้องได้มาก จึงทำให้ภาพชัดเจน แต่เนื่องจากแสงอัลตราไวโอเลตนี้ตาเรามองไม่เห็น จึงต้องบันทึกภาพไว้บนฟิล์ม

1.4 กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์ (fluorescence microscope) เป็นกล้องที่ใช้หลักการที่ให้จุลินทรีย์ย้อมสีฟลูออเรสเซนซ์ ซึ่งจะเกิดการเรืองแสงและสว่างขึ้นเมื่อผ่านรังสีอัลตราไวโอเลต จึงทำให้จุลินทรีย์ชัดเจนในฉากที่มืด สีที่นิยมใช้ย้อม เช่น สี auramine O สี acridine yellow สีฟลูออเรสเซนซ์ใช้มากในการหาปฏิกิริยาทางน้ำเหลืองวิทยา เรียกเทคนิคนี้ว่า fluorescent-antibody technique

1.5 กล้องจุลทรรศน์เฟสคอนทรัสต์ (phase contrast microscope) เป็นกล้องที่ใช้ศึกษาเซลล์ที่มีชีวิต โดยมีหลักการที่ใช้ phase contrast objective และ condenser พิเศษ (annular stop) ติดเข้าไปในกล้องจุลทรรศน์ที่ใช้แสงธรรมดา โดยการที่แสงผ่านวัตถุที่มีความหนาแน่นต่างกัน แสงจะหักเหออกไปมากน้อยต่างกัน ทำให้แต่ละส่วนของวัตถุมีความสว่างต่างกันด้วย จึงทำให้กล้องชนิดนี้แยกรายละเอียดของลักษณะภายในจุลินทรีย์ได้

2. กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน (electron microscope, EM) เป็นกล้องที่มีความแตกต่างจากกล้องจุลทรรศน์ธรรมดาหลายข้อ - มีกำลังขยายสูงมาก - มีความยาวคลื่นอิเล็กตรอนสั้นมาก คือ 0.05 Ao ดังนั้นจึงสามารถ แยกแยะรายละเอียดของวัตถุที่ขนาด 10 Ao ได้ และขยายภาพได้ถึง 400,000 เท่า - การทำให้เกิดภาพจะใช้สนามแม่เหล็กไฟฟ้า และการเตรียมตัวอย่างเพื่อ ใช้ศึกษาต้องเป็นตัวอย่างที่แห้งและเบามาก - ภาพที่ได้จะปรากฏบนฉากเรืองแสงหรือถ่ายภาพไว้ กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนมี 2 ชนิด คือ 2.1 กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่าน (Transmission EM, TEM) 2.2 กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องกราด (Scanning EM, SEM)

2.1 กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่าน (TEM) ใช้ในการศึกษาโครงสร้างภายในและรายละเอียดขององค์ประกอบภายในตัวอย่าง และยังสามารถใช้ศึกษารูปร่าง ขนาด และลักษณะภายนอกของตัวอย่างแบบสองมิติได้ Bacillus subtilis

2.2 กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องกราด (SEM) ใช้ในการศึกษาลักษณะทางสัณฐานและลักษณะพื้นผิวของตัวอย่าง แต่กำลังขยายที่ได้ไม่สูงเท่ากับ TEM

เปรียบเทียบระบบการเกิดภาพของกล้องจุลทรรศน์ 3 ชนิด

TEM SEM ข้อดี ข้อเสีย มีค่า resolution สูง ขยายภาพได้ ถึงแสนเท่า ไม่ต้องตัดชิ้นส่วนให้บาง สามารถมองเห็นภาพ 3 มิติได้ ข้อเสีย มีความสามารถในการทะลุทะลวง จำกัด ต้องใช้ชิ้นตัวอย่างที่บางมาก ไม่สามารถเห็นภาพ 3 มิติได้ ต้องผ่านกระบวนการเตรียม ตัวอย่างหลายขั้นตอน ทำให้ ตัวอย่างเหี่ยวย่นและเสียรูปทรงได้ - กำลังขยายไม่สูงเท่า TEM

การเตรียมวัตถุเพื่อศึกษาด้วยกล้องจุลทรรศน์ธรรมดา การเตรียมตัวอย่างเชื้อจุลินทรีย์เพื่อนำมาศึกษาด้วยกล้องจุลทรรศน์ที่ ใช้แสงธรรมดาอาจทำได้ 2 วิธี คือ - การเตรียมสไลด์สดและการทำเทคนิคหยดแขวน - การทำให้เซลล์แห้งตรึงอยู่กับที่ และย้อมสีเพื่อให้เห็นความแตกต่าง การเตรียมสไลด์สด วิธีนี้จะช่วยให้มองเห็นจุลินทรีย์ในสภาพธรรมชาติจริงๆ โดยที่จุลินทรีย์จะลอยอยู่ในของเหลว โดยหยดของเหลวที่มีจุลินทรีย์บนแผ่นแก้วสไลด์ ปิดทับด้วยกระจกปิดสไลด์ (cover slip)

การทำเทคนิคหยดแขวน (Hanging drop technique) มีลักษณะคล้ายการทำสไลด์สด แต่ให้หยดของเหลวที่มีจุลินทรีย์บนกระจกปิดสไลด์ก่อน แล้วจึงคว่ำสไลด์หลุมที่มีหลุมตรงกลางลงบนกระจกปิดสไลด์ให้บริเวณหลุมอยู่ตรงกลางเหนือหยดของเหลว แล้วพลิกสไลด์ให้หงายขึ้น หยดเชื้อจะแขวนอยู่กับกระจกปิดสไลด์และอยู่เหนือหลุมของสไลด์หลุมพอดี ข้อดี สามารถศึกษาเซลล์ที่มีชีวิตได้ สังเกตรูปร่างและการเรียงตัวของเซลล์ ได้ชัดเจน สามารถศึกษาพฤติกรรมต่างๆ ของเซลล์ ได้ เช่น การเคลื่อนที่ สามารถศึกษาถึงองค์ประกอบต่างๆ ภาย ในเซลล์

การย้อมสีจุลินทรีย์ (Staining) เนื่องจากจุลินทรีย์มีขนาดเล็กมากและมักโปร่งแสง จึงแยกความแตกต่างกับของเหลวที่จุลินทรีย์แขวนลอยอยู่ได้น้อย ทำให้มองเห็นได้ยาก ดังนั้นการย้อมสีจะช่วยให้เห็นรายละเอียดและความแตกต่างของจุลินทรีย์แต่ละชนิดได้มากขึ้น สีที่ใช้ย้อมจุลินทรีย์พวกแบคทีเรีย แบ่งออกเป็น 2 ชนิด คือ 1. สีที่มีคุณสมบัติเป็นกรดหรือมีประจุลบ (acid dye หรือ ionic dye) ตัวทำให้เกิดสีมีประจุเป็นลบ จึงย้อมติดกับสารที่มีประจุไฟฟ้าเป็นบวก ได้แก่สีอีโอซิน (eosin) 2. สีที่มีสมบัติเป็นเบสหรือมีประจุบวก (basic dye หรือ cationic dye) ตัวที่ทำให้เกิดสีมีประจุไฟฟ้าเป็นบวก จึงย้อมติดกับสารที่มีประจุไฟฟ้าเป็นลบได้ดี ได้แก่สีเมทิลีนบลู (methylene blue)

วิธีการเตรียมสเมียร์เชื้อ (smear preparation) 2. Air dry 3. Heat fix 4. Staining

วิธีการย้อมสีแบคทีเรีย มีวิธีการที่สำคัญ 2 แบบ คือ การย้อมสีแบบธรรมดา (simple staining) โดยใช้สีชนิดเดียวย้อมเซลล์ทิ้งไว้ระยะหนึ่ง หลังจากนั้นล้างออกด้วยน้ำและซับให้แห้ง เซลล์จะย้อมติดสีสม่ำเสมอกัน การย้อมแบบนี้เพื่อศึกษารูปร่างและขนาดของเซลล์ ตัวอย่างสีที่ใช้ เช่น crystal violet (A), methylene blue (B) และ carbol fuchsin (C) เป็นต้น

2. การย้อมมากกว่าหนึ่งสี (differential staining) โดยการใช้สีย้อมมากกว่าหนึ่งชนิด ทำให้สีย้อมติดส่วนต่างๆ ของเซลล์ไม่เท่ากัน จึงเห็นความแตกต่างระหว่างเซลล์หรือองค์ประกอบของเซลล์ 2.1 การย้อมสีแบบแกรม (Gram staining) การย้อมสีแบบนี้มีความสำคัญที่สุด และใช้กันแพร่หลาย สามารถใช้ศึกษา รูปร่างลักษณะและการจัดเรียงตัวของ เซลล์ และทำให้จำแนกแบคทีเรียออก เป็นสองชนิดคือ แบคทีเรียแกรมบวก และแบคทีเรียแกรมลบ

ข้อจำกัดของการย้อมสีแบบแกรม อายุของเชื้อ ถ้าแก่ แบคทีเรียแกรมบวกจะ สูญเสียความสามารถในการติดสี crystal violet ทำให้ติดสีแกรมลบแทน ขึ้นกับสภาพแวดล้อมของแบคทีเรีย หรือขึ้นกับวิธีการเกลี่ยเชื้อ วีธีการย้อมสี และคุณภาพของสีที่ใช้ Gram positive bacteria Gram negative bacteria

2.2 การย้อมสีแบบทนกรด (Acid-fast staining) แบคทีเรียบางชนิดมีความสามารถที่จะทนต่อการล้างด้วย acid alcohol เราเรียกแบคทีเรียพวกนี้ว่าแบคทีเรียทนกรด (acid-fast bacteria) เนื่องจากมีปริมาณไขมันในเซลล์สูง เช่น mycolic acid ได้แก่แบคทีเรียกลุ่ม Mycobacterium เช่น M. tuberculosis สาเหตุของวัณโรค และ M. leprae สาเหตุของ โรคเรื้อน

2.3 การย้อมสีสปอร์(Spore staining) แบคทีเรียบางชนิด เช่น ในจีนัส Bacillus และ Clostridium จะมีการสร้างสปอร์ภายในเซลล์เรียกว่า endospore ซึ่งสปอร์จะติดสีย้อมยาก แต่ เมื่อติดแล้วก็ล้างออกยากด้วย จึงต้องใช้ความ ร้อนช่วยเพื่อให้ติดสีมากขึ้นและเร็วขึ้น การ ย้อมสปอร์ช่วยให้ศึกษาขนาดรูปร่างและ ตำแหน่งของสปอร์ได้ วิธีย้อมนิยมใช้วิธีของ Schaeffer และ Fulton โดยใช้สี malachite green ย้อมสปอร์ และย้อมเซลล์ด้วยสีแดงของ safranin

2.4 การย้อมสีโครงสร้างต่างๆ ของเซลล์แบคทีเรีย โครงสร้างต่างๆ ของเซลล์แบคทีเรีย เช่น แฟลกเจลลา แคปซูล ผนังเซลล์ เม็ดแกรนูลต่างๆ ต้องใช้วิธีการย้อมด้วยเทคนิคพิเศษ จึงจะเห็นความแตกต่างของโครงสร้างเหล่านั้น

2.5 การย้อมสีแบบลบ (negative staining) การย้อมแบบลบตัวเซลล์แบคทีเรียจะไม่ติดสีย้อม แต่สีจะไปติดแน่นกับแผ่นสไลด์แทน จึงมองเห็นฉากมืด ส่วนตัวเซลล์แบคทีเรียจะโปร่งแสง สีที่นิยมคือ หมึกอินเดีย หรือสีนิโกรซิน วิธีนี้มีข้อดีคือ ทำให้ขนาดและ รูปร่างของแบคทีเรียไม่เปลี่ยนแปลง เนื่องจากไม่มีการใช้ความร้อนซึ่งจะทำให้ ขนาดเล็กลงและรูปร่างบิดเบี้ยวจากความ เป็นจริง