Nutrient and Growth of Microorganisms Thanut Amatayakul AIT 101 Microbiology Faculty of Agricultural Product Innovation and Technology Srinakharinwirot University

Outline Nutrients : Carbon, energy, electron Others nutrients and function Growth factors Nutrients uptake Environmental Effects on Microbial Growth Microbial growth Growth and Growth curve Culture media

Nutrients nutrition – กระบวนการซึ่งสารเคมี (สารอาหาร) จากสิ่งแวดล้อมถูกใช้เพื่อ กิจกรรมการดำรงชีพของเซลล์เชื้อจุลินทรีย์ essential nutrients - เป็นสารอาหารที่มีความจำเป็นต่อการดำรงชีพของ เชื้อจุลินทรีย์ Two categories of essential nutrients: macronutrients – มีความต้องการในปริมาณมาก และมีบทบาทในโครงสร้าง และการทำงานของเซลล์ proteins, carbohydrates micronutrients or trace elements – เซลล์มีความต้องการน้อย เกี่ยวข้องกับการทำงานของเอ็นไซม์ และโครงสร้างของโปรตีน manganese, zinc, nickel

Nutrients Inorganic nutrients– อะตอมหรือโมเลกุลที่มีอะตอมของธาติอื่นๆ นอกจากคาร์บอนและไฮโดนเจน metals and their salts (magnesium sulfate, ferric nitrate, sodium phosphate), gases (oxygen, carbon dioxide) and water Organic nutrients- สารอาหารประกอบขึ้นจากอะตอมของคาร์บอน และไฮโดรเจน ซึ่งส่วนใหญ่จะเป็นผลิตภัณฑ์จากสิ่งมีชีวิต methane (CH4), carbohydrates, lipids, proteins, and nucleic acids

ส่วนประกอบหลักของเซลล์แบคทีเรีย มีน้ำเป็นส่วนประกอบหลัก กว่า 70% http://textbookofbacteriology.net/nutgro.html

แหล่งของคาร์บอน พลังงาน และ อิเล็คตรอน carbon Autotrophs CO2 sole or principal biosynthetic carbon Source Heterotrophs Reduced, preformed, organic molecules from other organisms Energy Phototrophs Light Chemotroph Oxidation of Organic or inorganic compounds electron Lithotrophs Reduced inorganic molecules Organotrophs Organic molecules

Nutrients and Function in microbial cell N เป็นส่วนประกอบของ DNA, RNA, ATP โครงสร้างของโปรตีน อาจสร้างขึ้นเองหรือๆได้มาในรูป (NO3-, NO2-, or NH3) เมื่อเข้าไปในเซลล์จะอยู่ในรูป NH3 เพื่อการสร้าง amino acids O เป็นส่วนประกอบหลักของโครงสร้างไขมัน โปรตีน คาร์โบไฮเดรต สามารถได้มาจาก inorganic salt หรือ organic H เป็นส่วนประกอบในโครงสร้างสารอินทรีย์ ควบคุม pH สร้าง H bond และเป็นแหล่งของพลังงานในกระบวนการ oxidation reduction หรือ ขกระบวนการหายใจ

Nutrients and Function in microbial cell P เป็นส่วนประกอบของ nucleic acid และ ATP S เป็นส่วนประกอบของโปรตีน สร้างพันธะ disulfide ทำให้เกิดโครงสร้างโปรตีน K มีความจำเป็นในการสร้างโปรตีนและหน้าที่ของเยื่อหุ้มเซลล์ Na มีความสำคัญกับการถ่ายเทสาร Ca ทำให้ผนังเซลล์และ endospore มีความแข็งแรง Mg เป็นส่วนประกอบของคลอโรฟิล Fe ส่วนประกอบของโปรตีนในกระบวนการหายใจ (co-factor) Zinc, copper, nickel, manganese, etc.

Growth Factors: Essential Organic Nutrients สารอินทรีย์ที่ไม่สามารถผลิตขึ้นได้โดยเชื้อจุลินทรีย์เนื่องจากไม่มีกลไก ทางด้านพันธุกรรมหรือกระบวนการเมตาบอลิซึมที่สามารถใช้ในการ สร้างได้ จำเป้นต้องได้รับจากสิ่งแวดล้อม essential amino acids (สร้างโปรตีน), purines and Pyrimidines (สังเคราะห์สารพันธุกรรม) vitamins

Nutrients Uptake Passive transport –does not require energy; substances exist in a gradient and move from areas of higher concentration towards areas of lower concentration diffusion osmosis – diffusion of water facilitated diffusion – requires a carrier Active transport – requires energy and carrier proteins; gradient independent active transport group translocation – transported molecule chemically altered bulk transport – endocytosis, exocytosis, pinocytosis

Environmental Effects on Microbial Growth Temperature pH Osmotic pressure Oxygen classes

Temperature Minimum Temperature: Temperature below which growth ceases, or lowest temperature at which microbes will grow. Optimum Temperature: Temperature at which its growth rate is the fastest. Maximum Temperature: Temperature above which growth ceases, or highest temperature at which microbes will grow.

Temperature and Microbial Growth Cardinal temperatures minimum optimum maximum Temperature is a major environmental factor controlling microbial growth.

Classification of Microorganisms by Temperature Requirements

pH and Microbial Growth pH – measure of [H+] each organism has a pH range and a pH optimum acidophiles – optimum in pH range 1-4 alkalophiles – optimum in pH range 8.5-11 lactic acid bacteria – 4-7 Thiobacillus thiooxidans – 2.2-2.8 fungi – 4-6 internal pH regulated by BUFFERS and near neutral adjusted with ion pumps Human blood and tissues has pH 7.2+0.2

pH and Microbial Growth The acidity or alkalinity of an environment can greatly affect microbial growth. Most organisms grow best between pH 6 and 8, but some organisms have evolved to grow best at low or high pH. The internal pH of a cell must stay relatively close to neutral even though the external pH is highly acidic or basic. Acidophiles : organisms that grow best at low pH ( Helicobacter pylori, Thiobacillus thiooxidans ) Alkaliphiles : organismsa that grow best at high pH ( Vibrio cholera) Most of pathogenic bacteria are neutrophiles

Osmotic Effects on Microbial Growth Osmotic pressure depends on the surrounding solute concentration and water availability Water availability is generally expressed in physical terms such as water activity (aw) Water activity is the ratio of the vapor pressure of the air in equilibrium with a substance or solution to the vapor pressure of pure water ( aw 1.00). aw= P solu P water

Environmental factors and growth 1. Osmotic Effect and water activity organisms which thrive in high solute – osmophiles organisms which tolerate high solute – osmotolerant organisms which thrive in high salt – halophiles organisms which tolerate high salt – halotolerant organisms which thrive in high pressure – barophiles organisms which tolerate high pressure – barotolerant

Halophiles and Related Organisms In nature, osmotic effects are of interest mainly in habitats with high salt environments that have reduced water availability Halophiles : have evolved to grow best at reduced water potential, and some (extreme halophiles e.g. Halobacterium, Dunaliella ) even require high levels of salts for growth. Halotolerant : can tolerate some reduction in the water activity of their environment but generally grow best in the absence of the added solute Xerophiles : are able to grow in very dry environments

Classification of organisms based on O2 utilization Utilization of O2 during metabolism yields toxic by-products including O2-, singlet oxygen (1O2) and/or H2O2. Toxic O2 products can be converted to harmless substances if the organism has catalase (or peroxidase) and superoxide dismutase (SOD) SOD converts O2- into H2O2 and O2 Catalase breaks down H2O2 into H2O and O2 Any organism that can live in or requires O2 has SOD and catalase (peroxidase)

Classification of organisms based on O2 utilization Obligate (strict) aerobes require O2 in order to grow Obligate (strict) anaerobes cannot survive in O2 Facultative anaerobes grow better in O2 Aerotolerant organisms don’t care about O2 Microaerophiles require low levels of O2

Oxygen and Microbial Growth Aerobes : Obligate : require oxygen to grow Facultative : can live with or without oxygen but grow better with oxygen Microaerphiles : require reduced level of oxygen Anaerobes : Aerotolerant anaerobes : can tolerate oxygen but grow better without oxygen. Obligate : do not require oxygen. Obligate anaerobes are killed by oxygen

Test for Oxygen Requirements of Microorganisms Thioglycolate broth : contains a reducing agent and provides aerobic and anaerobic conditions Aerobic Anaerobic Facultative Microaerophil Aerotolerant

Toxic Forms of Oxygen and Detoxifying Enzymes Hydrogen peroxide Superoxide

Environmental factors and growth 4. Oxygen anaerobes lack superoxide dismutase and/or catalase anaerobes need high -, something to remove O2 chemical: thioglycollate; pyrogallol + NaOH H2 generator + catalyst physical: removal/replacement

Special Culture Techniques Candle Jar

Special Culture Techniques Gas Pack Jar Is Used for Anaerobic Growth

The Study of Microbial Growth Microbial growth occurs at two levels: growth at a cellular level with increase in size, and increase in population Division of bacterial cells occurs mainly through binary fission (transverse) parent cell enlarges, duplicates its chromosome, and forms a central transverse septum dividing the cell into two daughter cells 37

Bacterial growth

Cell devision

43

The Population Growth Curve In laboratory studies, populations typically display a predictable pattern over time – growth curve. Stages in the normal growth curve: Lag phase – “flat” period of adjustment, enlargement; little growth Exponential growth phase – a period of maximum growth will continue as long as cells have adequate nutrients and a favorable environment Stationary phase – rate of cell growth equals rate of cell death caused by depleted nutrients and O2, excretion of organic acids and pollutants Death phase – as limiting factors intensify, cells die exponentially in their own wastes 44

Culture Media

Culture Media: Composition Culture media supply the nutritional needs of microorganisms ( C ,N, Phosphorus, trace elements, etc) defined medium : precise amounts of highly purified chemicals complex medium (or undefined) : highly nutritious substances. In clinical microbiology, Selective : contains compounds that selectively inhibit Differential: contains indicator terms that describe media used for the isolation of particular species or for comparative studies of microorganisms.

Chemical Composition of Culture Media Synthetic Media Chemically defined Contain pure organic and inorganic compounds Exact formula (little variation) Complex or Non-synthetic Media Contains at least one ingredient that is not chemically definable (extracts from plants and animals) No exact formula / tend to be general and grow a wide variety of organisms

Selective Media Contains one or more agents that inhibit the growth of a certain microbe and thereby encourages, or selects, a specific microbe. Example: Mannitol Salt Agar [MSA] encourages the growth of S. aureus. MSA contain 7.5% NaCl which inhibit the growth of other Gram +ve bacteria

Growth of Staphylococcus aureus on Mannitol Salt Agar results in a color change in the media from pink to yellow.

Differential Media Differential shows up as visible changes or variations in colony size or color, in media color changes, or in the formation of gas bubbles and precipitates. Example: Spirit Blue Agar to detect the digestion of fats by lipase enzyme. Positive digestion (hydrolysis) is indicated by the dark blue color that develops in the colonies. Blood agar for hemolysis (α,β,and γ hemolysis), EMB, MacConkey Agar, …etc.

Enrichment Media Is used to encourage the growth of a particular microorganism in a mixed culture. Ex. Manitol Salt Agar for S. aureus Blood agar , chocolate agar, Slenite F broth

Example of Microbial Culture collection

the roles played by microbial culture collections:   (i) to collect,maintain and dispatch microbial cultures, (ii) to collect culture data and make them accessible to the microbiological research community via printed or online catalogues., (iii) to act as safely deposits of microorganisms with restricted distribution, (iv) to provide identification services, (v) to serve as repositories for valuable cultures., (vi) to organize training courses and workshops (vii) to carry out research related mainly to taxonomy and microbiological preservation, (viii) to provide general advice in the field of microbiology

TNCC ศูนย์เก็บรักษาจุลินทรีย์แห่งประเทศไทย (TNCC) จัดตั้งขึ้นในปลายปี 2543 หลังจากที่ได้มีการเตรียมการมาเป็นเวลา 5 ปี มีการดำเนินงานในระยะแรกโดยความร่วมมือของหน่วยงานหลัก 4 แห่งที่มีศักยภาพในด้านการเก็บรักษาจุลินทรีย์, มีความพร้อมในด้านห้องปฏิบัติการ และบุคคลากรที่มีความเชี่ยวชาญในการเก็บเชื้อจุลินทรีย์ รวมทั้งยังมีความพร้อมในการที่จะรองรับกิจกรรมทางด้านการเก็บรักษาจุลินทรีย์ของประเทศ หน่วยงานดังกล่าวนี้ได้แก่ หน่วยเก็บรักษาจุลินทรีย์เฉพาะทาง ของศูนย์พันธุวิศวกรรมและเทคโนโลยีชีวภาพแห่งชาติ (BCC), หน่วยเก็บรักษาจุลินทรีย์ทางการแพทย์ กรมวิทยาศาสตร์การแพทย์ (DMST), หน่วยเก็บรักษาจุลินทรีย์ทางการเกษตร กรมวิชาการเกษตร (DOA) และ ศูนย์จุลินทรีย์ สถาบันวิจัยวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีแห่งประเทศไทย (TISTR)