Introduction to Animal Virus ดร. ยิ่งมณี ตระกูลพัว

กำเนิดของไวรัส สมมุติฐาน 3 ประการ 1. Regressive therory ยีนที่ไม่ต้องการจะมีการสูญหาย ทำให้จุลชีพมีขนาดเล็กลง เชื่อว่าไวรัสเกิดภายหลังจากที่เซลล์เกิดขึ้น ไวรัสมีวิวัฒนาการจากโมเลกุลที่ง่ายที่สุด เชื่อว่าไวรัสเกิดพร้อมกับสิ่งมีชีวิตชนิดอื่น RNA น่าจะเป็นจุดกำเนิดของชีวิต ไวรัสชนิดแรกน่าจะเป็น RNA virus

3. ไวรัสมีต้นกำเนิดจาก RNA หรือ DNA ของเซลล์ พบว่ายีนที่สร้างเอนไซม์ RNA polymerase มีลำดับเบสบางส่วนคงที่ เชื่อว่าไวรัสได้ยีนบางอย่างมาจากเซลล์ด้วยวิธี Recombination เนื่องจาก RNA virus ขนาดใหญ่มีเอนไซม์ที่คล้ายกับของ host cell เชื่อว่าไวรัสเกิดภายหลังจากที่เซลล์เกิดขึ้น

Viruses ภาษาละติน แปลว่า สารพิษ จุลชีพขนาดเล็ก (20-350 นาโนเมตร) ตรวจหาโดยใช้กล้องจุลทรรศน์อิเลคตรอน เพิ่มจำนวนได้ในสิ่งมีชีวิตเท่านั้น จึงจัดเป็น Obligate intracellular microorgamism

การค้นพบเชื้อไวรัส ค.ศ. 1892 : Dimitri Iwanowski สารสกัดจากใบยาสูบที่เป็นโรค ผ่านเครื่องกรองแบคทีเรีย ก่อโรคติดเชื้อในพืชต้นอื่น ค.ศ. 1898 : Martinus Beijerinick Tabacco mosaic virus เป็นสาเหตุก่อโรคในต้นใบยาสูบ

ค.ศ. 1898 Loeffler and Frosch ค้นพบ Foot and mouth disease virus ค.ศ. 1909 Karl Landsteiner และ E.Popper พบว่า poliomyelitis มีสาเหตุมาจากเชื้อไวรัส

ค.ศ. 1915-1917 Frederick Twort และ Felix d’ Herelle ค้นพบ Bacteriophage (eater of bacteria) หลังจากปี 1930 มีการศึกษาลักษณะ โครงสร้าง พันธุศาสตร์ และการเพิ่มจำนวนของเชื้อไวรัส

การศึกษาคุณสมบัติของเชื้อไวรัส วิธีทางฟิสิกส์ (Physical method) วิธีทางเคมี (Chemical method) การใช้กล้องจุลทรรศน์อิเลคตรอน (Electron microscopy)

1. วิธีทางฟิสิกส์ ตรวจคุณสมบัติในการตกตะกอนของไวรัส 1. วิธีทางฟิสิกส์ ตรวจคุณสมบัติในการตกตะกอนของไวรัส - ปั่นตกตะกอนด้วยเครื่อง ultracentrifuge - ตรวจวัด Relative density ของอนุภาคไวรัส - ทำให้ไวรัสบริสุทธิ์ และไวรัสในปริมาณที่มาก

Ultracentrifugation (UC) - ปั่นตกตะกอนด้วยความเร็วสูง ผ่าน homogenous medium; sucrose,CsCl

1) Zonal Ultracentrifugation แยกอนุภาคไวรัสที่บริสุทธิ์โดยใช้ความแตกต่างด้านขนาด และรูปร่าง ใช้ sucrose gradient

เติมตัวอย่างลงใน gradient อัตราการตกตะกอน (Sedimentation rate) แสดงเป็น sedimentation coefficient, S อัตราการตกตะกอนขึ้นกับขนาดของโมเลกุล ปั่นแยก Sedimentation coefficient ที่ 1x10-13 วินาทีเรียกว่า Svedberg (S) unit

2) Equilibrium density gradient ultracentrifugation ตัวอย่าง + สารลาย CsCl, Cs2SO4 ปั่นตกตะกอนจนถึงจุดสมดุล เกิด gradient ของความเข้มข้น โดยความหนาแน่น จะเพิ่มขึ้นไปตามทิศทางของแรงปั่นตกตะกอน

ตำแหน่งของส่วนประกอบแต่ละส่วนจะอยู่ที่ ตำแหน่งที่ความหนาแน่นของสารละลาย CsCL (solution density) = ความหนาแน่นของการลอยตัวของสารละลาย CsCL (buoyant density) แยกส่วนประกอบที่เห็นเป็นแถบได้อย่างชัดเจน

(2) ตรวจสอบโดยเครื่อง Spectrophotometer ปริมาณกรดนิวคลีอิค : ตรวจสอบในช่วงคลื่น ultraviolet light คุณสมบัติในการกระจายแสง : ตรวจสอบในช่วงคลื่น visible light

(3) ตรวจสอบโดยเครื่อง Electrophoresis วิเคราะห์กรดนิวคลีอิค วิเคราะห์โปรตีน

(4) ตรวจสอบโดยใช้ X-ray crystallography ศึกษาโครงสร้างของไวรัส โดยใช้ ammonium sulphate หรือเกลือ

Crystallographic structure 1935: Tobacco mosaic virus (TMV) ตกผลึกโดย W. M. Stanley มีโครงสร้างเป็นแบบ helical structure 1950: Turnip yellow mosaic virus (TYMV) มีโครงสร้างเป็นแบบ isometric structure

Rhinovirus 14 (a common cold virus) as solved by X-ray crystallography

-ใช้สารที่ทำลายโปรตีน; urea,phenol,detergent 2. วิธีทางเคมี ตรวจหาชนิดกรดนิวคลีอิคของไวรัส ตรวจส่วนประกอบของโปรตีนในแคปซิดของไวรัส -การเปลี่ยนแปลง pH -ใช้สารที่ทำลายโปรตีน; urea,phenol,detergent Urea แยกโปรตีนที่จับกันโดย hydrophobic interaction Detergent แยกการจับกันของโปรตีน และไขมัน

3. การใช้กล้องจุลทรรศน์อิเลคตรอน (Electron microscopy) พัฒนาในปี 1930 แบ่งเป็น 2 ชนิด Transmission electron microscope (TEM) Scanning electron microscope (SEM) ใช้ลำแสงอิเลคตรอน ตรวจดูวัตถุที่มีขนาดเล็กกว่า 0.2 ไมโครเมตร สามารถบอกรายละเอียดของโครงสร้างไวรัส และจำนวนอนุภาคไวรัสทั้งหมด (Total count)

Transmission electron microscope (TEM) สามารถเห็นโครงสร้างวัตถุ ภายในและภายนอก เตรียมตัวอย่างบน supporting mesh แล้วทำให้เป็นแผ่นบาง บนผิวของตัวอย่าง coat ด้วยชั้นของคาร์บอน

TEM

TEM ความแตกต่างระหว่าง ultrastructure และ background ต่ำ มีการย้อมสีเพื่อเพื่อความแตกต่าง โดยมีการดูดลำแสงอิเลคตรอนทำให้ภาพชัดขึ้น Negative stain ใช้ electron-dense dye: phosphotungstic acid, uranyl acetate เพิ่ม electro opacity รอบตัวอย่าง Positive stain ใช้ อิออนของโลหะขนาดเล็ก สามารถแทรกในตัวอย่างได้ มองเห็นตัวอย่างเป็น 2 มิติ และขยายขนาดของวัตถุ 10,000 -100,000 เท่า

Negative staining only electrons which pass through the specimen are involved in the formation of the final image

Electron Micrograph Images Herpes simplex virus type 2 Influenza virus

Scanning electron microscope (SEM) มองเห็นตัวอย่างเป็น 3 มิติ และขยายขนาดของวัตถุ 1,000 -10,000 เท่า

SEM

EM ใช้แอนติบอดีที่จำเพาะกับไวรัสแอนติเจน การตรวจโดย EM อาจมีความผิดพลาดเนื่องจาก cellular organelle เช่น ribosome ใช้แอนติบอดีที่จำเพาะกับไวรัสแอนติเจน เชื่อม Antibody กับ electron-dense marker : iron-containing protein ferritin, colloidal gold immunoelectron microscopy