Department of Biochemistry, Faculty of Science, Mahidol University DNA Technology http://www.sinauer.com/cooper/4e/index.html http://www.sahavicha.com/?name=knowledge&file=readknowledge&id=1358 Assoc. Prof. Rutaiwan Tohtong Department of Biochemistry Faculty of Science rutaiwan@gmail.com

Objectives Explain the principle and strategy for DNA cloning Department of Biochemistry, Faculty of Science, Mahidol University Objectives Explain the principle and strategy for DNA cloning Explain the function and mechanism of key restriction enzymes frequently used in DNA technology Explain the principle and mechanism of PCR reaction Describe the principle of key techniques used in DNA technology Describe how to apply the appropriate DNA technology in medicine, agriculture, biotechnology and others

Department of Biochemistry, Faculty of Science, Mahidol University Outline What is “gene technology” and its significance? What is “cloning”? How to “clone” a piece of DNA? Cloning vectors Restriction enzymes Introduction of DNA into host cells & selection of the desired clones PCR DNA fingerprinting Uses of DNA technology

Applications of DNA Technology Department of Biochemistry, Faculty of Science, Mahidol University Applications of DNA Technology Medicine Agriculture

What is DNA technology? การศึกษา DNA ในระดับโมเลกุล Department of Biochemistry, Faculty of Science, Mahidol University What is DNA technology? DNA technology is the technology that is utilized to study, to manipulate, or to modify the DNA to our specification การศึกษา DNA ในระดับโมเลกุล DNA Cloning คือขบวนการที่ให้ได้มาซึ่ง DNA หรือ ยีน ที่สนใจจำนวนมาก แต่ละโมเลกุลมีข้อมูลพันธุกรรมที่เหมือนกันทุกประการ เพื่อให้มีจำนวนมากพอที่จะนำไปศึกษาหรือทำประโยชน์อื่นๆได้ Clone คือกลุ่มสิ่งมีชีวิตที่มีสารพันธุกรรมเหมือนกันทุกประการ

What is the meaning of “cloning”? Department of Biochemistry, Faculty of Science, Mahidol University What is the meaning of “cloning”? Cloning is a technique to make multiple individuals with identical genetic make-up

Department of Biochemistry, Faculty of Science, Mahidol University  Cloning X

To clone an individual or To clone an animal Department of Biochemistry, Faculty of Science, Mahidol University To clone an individual or To clone an animal Clone a new individual from somatic cells of parents. Dolly was the first cloned animal in 1997.

Department of Biochemistry, Faculty of Science, Mahidol University

To clone a gene is to isolate the gene of interest Department of Biochemistry, Faculty of Science, Mahidol University To clone a gene is to isolate the gene of interest from the pool (genome) and to propagate it to multiple copies

Department of Biochemistry, Faculty of Science, Mahidol University To manipulate or modify the gene of interest, we must obtain the gene in pure form and in sufficient amount. To increase the amount of the gene, we must insert the gene into a plasmid vector, creating a ‘recombinant DNA’, before putting it back into E. coli for propagation.

Strategy of DNA Cloning Department of Biochemistry, Faculty of Science, Mahidol University Strategy of DNA Cloning Select for the desired recombinant clone for further propagation Introduction of the recombinant DNA into appropriate host cells Ligate both DNAs together using DNA ligase Cut both DNAs with appropriate restriction enzymes Purify the gene of interest & the cloning vector ถาม ทำไมต้องมี DNA พาหะ ตอบ เพราะเป็นการป้องกันไม่ให DNA ที่สนใจถูกทำลาย (ไม่นับว่าเป็นสิ่งแปลกปลอม)

Department of Biochemistry, Faculty of Science, Mahidol University Cloning Vectors Plasmid is an ‘extrachromosomal’ DNA which replicates indenpendently of the chromosomes. It is the most frequently used vector for cloning. While chromosomes contain most of the genetic information, plasmids contain a few genes. While chromosomes replicate only once, plasmids can undergo multiple rounds of DNA replication during a cell division cycle resulting in multiple copies of plasmid DNAs per bacterial cells.

Cloning Vectors In bacteria (E. coli) Plasmids Bacteriophages Department of Biochemistry, Faculty of Science, Mahidol University Cloning Vectors In bacteria (E. coli) Plasmids Bacteriophages Bacterial Artificial Chromosomes (BACs) In yeast Yeast Artificial Chromosomes (YACs)

DNA พาหะ (Cloning Vectors) Department of Biochemistry, Faculty of Science, Mahidol University DNA พาหะ (Cloning Vectors) ชนิดของพาหะ รูปร่างของพาหะ ขนาดของชิ้น DNA ที่สามารถโคลนได้ (kb) Plasmid Circular double-stranded 1-5 Phage Linear double-stranded 2-25 Cosmid 35-45 BACs 50-300 YACs 100-2000

Cloning Vectors: Plasmid Department of Biochemistry, Faculty of Science, Mahidol University Cloning Vectors: Plasmid Origin of Replication Multiple Cloning Site Selectable Marker Plasmids are circular double-stranded DNA molecules that replicate separately from the host chromosome. Genetic map of the plasmid pBR322

Department of Biochemistry, Faculty of Science, Mahidol University Expression Vector Origin of Replication Multiple Cloning Site Selectable Marker

Department of Biochemistry, Faculty of Science, Mahidol University www.invitrogen.com

Restriction enzymes (เอนไซม์ตัดจำเพาะ) Department of Biochemistry, Faculty of Science, Mahidol University Restriction enzymes (เอนไซม์ตัดจำเพาะ) Restriction endonucleases เป็นเอนไซม์ที่พบใน microorganisms มี 3 ชนิด คือ Type I, Type II และ Type III ชนิดที่ใช้ในทางพันธุวิศวกรรม คือ Type II หน้าที่ของเอนไซม์ => ตัด phosphodiester bond เอนไซม์จะตัดจำเพาะที่ลําดับเบสที่มีความยาวตั้งแต่ 4-8 คู่เบส โดยทั่วไปพบ 6 คู่เบส เบสที่เอนไซม์จดจำมีลักษณะเป็น Palindromic sequence เช่น —GAATTC— เมื่อเอนไซม์ตัด DNA จะให้ผลผลิตเป็นปลายหยัก (Sticky end, Staggered end) หรือปลายทู่ (Blunt end) Biological function: To recognize and cleave foreign DNA

Department of Biochemistry, Faculty of Science, Mahidol University

Department of Biochemistry, Faculty of Science, Mahidol University (sticky end) (blunt end)

Department of Biochemistry, Faculty of Science, Mahidol University

DNA Ligase หน้าที่ของเอนไซม์ Ligase Department of Biochemistry, Faculty of Science, Mahidol University DNA Ligase หน้าที่ของเอนไซม์ Ligase  สร้างพันธะ Phosphodiester ระหว่างนิวคลีโอไทด์ (double-stranded DNA molecules)  เชื่อมต่อ DNA พาหะกับ DNA ที่สนใจ ชนิดของเอนไซม์ Ligase T4 DNA Ligase ใช้ ATP E.coli DNA Ligase ใช้ NAD+ Q1: How does E. coli DNA Ligase differ from T4 DNA Ligase? A1: Under recommended conditions E. coli DNA Ligase will not join blunt ends nor DNA to RNA. E. coli DNA Ligase is more specific for cohesive ends than T4 DNA Ligase (NEB# M0202). http://www.neb.com/nebecomm/products/faqproductM0205.asp#309

Mechanism of the DNA ligase reaction Department of Biochemistry, Faculty of Science, Mahidol University Mechanism of the DNA ligase reaction

การนำ recombinant DNA (ดีเอ็นเอสายผสม) เข้าสู่เซลล์เจ้าบ้าน Department of Biochemistry, Faculty of Science, Mahidol University การนำ recombinant DNA (ดีเอ็นเอสายผสม) เข้าสู่เซลล์เจ้าบ้าน 1. Transformation เป็นการนำดีเอ็นเอในรูป plasmid เข้าสู่เซลล์ผู้รับ (E. Coli ) โดยทำให้เซลล์ผู้รับเป็น competent cell ก่อน 2. Transduction เป็นการนำดีเอ็นเอของ cosmid, lamda phage ที่มีขนาดใหญ่เข้าสู่เซลล์ผู้รับ โดยบรรจุลงในอนุภาคของ phage ก่อนแล้วจึงนำเข้าเซลล์ วิธีนี้มีประสิทธิภาพสูงกว่า Transformation 3. Electroporation ใช้กระแสไฟฟ้าทำให้เกิดรูที่เยื่อหุ้มเซลล์ ทำให้ดีเอ็นเอหรือพลาสมิดเข้าสู่เซลล์ได้ การนำ recombinant DNA เข้าสู่เซลล์ การใช้สารเคมี เช่น dimethyl sulfoxide-DMSO, CaCl2, MgCl2

Department of Biochemistry, Faculty of Science, Mahidol University Transformation Bacterial host cells competent cells CaCl2 Plasmid 0 C Heat shock Plasmid replication Repair 42 C Cells division

Department of Biochemistry, Faculty of Science, Mahidol University Transduction Electroporation

การคัดเลือกเซลล์ที่มีดีเอ็นเอสายผสมที่ต้องการ Department of Biochemistry, Faculty of Science, Mahidol University การคัดเลือกเซลล์ที่มีดีเอ็นเอสายผสมที่ต้องการ 1. การคัดเลือกโดยอาศัยลักษณะ (phenotype) เป็นการอาศัยการแสดงออกของยีนเครื่องหมาย (marker gene) ที่สร้างโปรตีนออกมาหรือโปรตีนที่สามารถดื้อต่อยาปฏิชีวนะ 2. การคัดเลือกโดย DNA hybridization อาศัยการจับคู่กันของสายดีเอ็นเอที่เป็นตัวติดตาม (probe) กับดีเอ็นเอเป้าหมายที่ต้องการตรวจหาที่มีลำดับเบสคู่สมกันบน membrane โดย probeจะติดฉลากด้วยสารไอโซโทปหรือเอนไซม์ 3. การคัดเลือกโดยวิธีทางอิมมิวโนวิทยา (Antigen-antibody interaction) เป็นการตรวจสอบโปรตีนที่เซลล์ผลิตขึ้นโดยใช้แอนติบอดีที่จำเพาะกับโปรตีนที่ต้องการนั้น เป็นการติดตามผลผลิตโปรตีนที่แปลจากรหัสพันธุกรรม

การคัดเลือกโดยอาศัยลักษณะ (phenotype) Department of Biochemistry, Faculty of Science, Mahidol University การคัดเลือกโดยอาศัยลักษณะ (phenotype) การคัดเลือก recombinant DNA แบ่งเป็น 2 ชั้นตอน 1. แยกเซลล์ที่มีพลาสมิดแยกออกจากเซลล์ที่ไม่มีพลาสมิดด้วยการใช้ยาปฏิชีวนะ 2. แยกเซลล์ที่มีพลาสมิดแบบที่มี insert (แบบที่ 1) ออกจากเซลล์ที่มีพลาสมิดแบบที่ไม่มี insert (แบบที่ 2) ด้วยสี blue-white

แยกเซลล์ที่มีพลาสมิดแยกออกจากเซลล์ที่ไม่มีพลาสมิดด้วยการใช้ยาปฏิชีวนะ Department of Biochemistry, Faculty of Science, Mahidol University แยกเซลล์ที่มีพลาสมิดแยกออกจากเซลล์ที่ไม่มีพลาสมิดด้วยการใช้ยาปฏิชีวนะ

Department of Biochemistry, Faculty of Science, Mahidol University แยกเซลล์ที่มีพลาสมิดแบบที่มี insert (แบบที่ 1) ออกจากเซลล์ที่มีพลาสมิดแบบที่ไม่มี insert (แบบที่ 2) ด้วยสี blue-white

การคัดเลือกโดยใช้สี blue-white Department of Biochemistry, Faculty of Science, Mahidol University การคัดเลือกโดยใช้สี blue-white Recombinant has no enzyme, positive colonies are white

การคัดเลือกโดย DNA hybridization Colony (in situ) hybridization Department of Biochemistry, Faculty of Science, Mahidol University การคัดเลือกโดย DNA hybridization Colony (in situ) hybridization

Polymerase chain reaction (PCR) Department of Biochemistry, Faculty of Science, Mahidol University Polymerase chain reaction (PCR) เป็นการทำปฏิกิริยาเพื่อให้ได้ DNA เพิ่มขึ้น ต่างจากการโคลนนิ่ง คือ PCR เกิดขึ้นในหลอดทดลอง หลักการจากคุณสมบัติการลอกรหัสของดีเอ็นเอ “DNA Replication” ประกอบด้วย 1. การแยกสายคู่ (Denaturation) อุณหภูมิที่ใช้ 96 องศา 2. การเกาะของไพรเมอร์ (Primer annealing) 3. การสังเคราะห์ DNA สายใหม่ (Synthesis) การเพิ่มปริมาณ DNA จะเกิดจากการทำปฏิกิริยา 3 ขั้นตอนนั้นซ้ำๆหลายรอบ

Department of Biochemistry, Faculty of Science, Mahidol University

PCR procedures Thermal Cycler Department of Biochemistry, Faculty of Science, Mahidol University PCR procedures Thermal Cycler

Department of Biochemistry, Faculty of Science, Mahidol University PCR: DNA polymerase การสังเคราะห์ DNA สายใหม่อาศัยการทำงานของเอนไซม์ DNA polymerase เอนไซม์ที่มีประสิทธิภาพดี ต้องทนความร้อน เช่น Taq polymerase (Thermus aquaticus) Taq polymerase Vent polymerase ไม่มี proof reading เหมาะสำหรับการวินิจฉัย DNA มี proof reading เหมาะสำหรับการศึกษาโครงสร้างของ DNA http://www.sinauer.com/cooper5e/animation0409.html

PCR procedures: components Department of Biochemistry, Faculty of Science, Mahidol University PCR procedures: components • Template DNA Primer dNTP mix Taq DNA polymerase Sterile deionised water • 10X PCR buffer • MgCl2 Thermal Cycler

Primer Oliogonucleotides (20-30 nt) ไม่เกิด Hairpin loop Department of Biochemistry, Faculty of Science, Mahidol University Primer Oliogonucleotides (20-30 nt) ไม่เกิด Hairpin loop ไม่เกิด primer dimer อุณหภูมิที่เหมาะสมในการเกาะของ primer กับ DNA แม่แบบ คำนวณได้จากสูตร Ta= 2(A+T) + 3 (G+C) C T C A A---T T---A G---C C---G 5’GACT CG3’ ตัวอย่างไพรเมอร์ ลองคำนวณหา Ta = 50 celcius 5’ GACTACGTAcctatacgtcg 3’

Department of Biochemistry, Faculty of Science, Mahidol University PCR: cycle 1

Department of Biochemistry, Faculty of Science, Mahidol University PCR: cycle 2

Department of Biochemistry, Faculty of Science, Mahidol University PCR: cycle 2

PCR: cycle 3 n cycles 2n fold Department of Biochemistry, Faculty of Science, Mahidol University PCR: cycle 3 n cycles 2n fold

Reverse Transcription-PCR Department of Biochemistry, Faculty of Science, Mahidol University Reverse Transcription-PCR (RT-PCR)

Exercise DNA replication PCR Department of Biochemistry, Faculty of Science, Mahidol University Exercise PCR DNA replication หลักการจากคุณสมบัติการลอกรหัสของดีเอ็นเอ “DNA Replication” ประกอบด้วย การแยกสายคู่ (Denaturation) อุณหภูมิที่ใช้ 96 องศา การเกาะของไพรเมอร์ (Primer annealing) การสังเคราะห์ DNA สายใหม่ (Synthesis) 1. Helicase 2. RNA Primase 3. DNA Polymerase

Enzymes used in recombinant DNA Technology Department of Biochemistry, Faculty of Science, Mahidol University Enzymes used in recombinant DNA Technology

เทคนิคการวิเคราะห์กรดนิวคลีอิก Department of Biochemistry, Faculty of Science, Mahidol University เทคนิคการวิเคราะห์กรดนิวคลีอิก Electrophoresis Hybridization ลายพิมพ์ DNA

Agarose Gel Electrophoresis Department of Biochemistry, Faculty of Science, Mahidol University Agarose Gel Electrophoresis Ethidium bromide staining

Hybridization Southern blot Northern blot Department of Biochemistry, Faculty of Science, Mahidol University Hybridization Southern blot Northern blot

ลายพิมพ์ DNA (DNA Fingerprint) Department of Biochemistry, Faculty of Science, Mahidol University ลายพิมพ์ DNA (DNA Fingerprint) พิสูจน์ความเป็นพ่อ-แม่-ลูก พิสูจน์ตัวผู้กระทำผิด

หลักการของ RFLP Technique  to detect a point mutation or polymorphism Department of Biochemistry, Faculty of Science, Mahidol University หลักการของ RFLP Technique  to detect a point mutation or polymorphism GAATTC GGATTC Normal gene A point mutated gene Restriction enzyme, EcoRI Generating 2 fragments Still 1 fragment - +

หาลำดับเบสที่แตกต่างบนสายดีเอ็นเอตำแหน่งต่างๆในยีโนม (polymorphisms) Department of Biochemistry, Faculty of Science, Mahidol University ขั้นตอนการหาลายพิมพ์ดีเอ็นเอโดย RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms) หาลำดับเบสที่แตกต่างบนสายดีเอ็นเอตำแหน่งต่างๆในยีโนม (polymorphisms) เอนไซม์ตัดจำเพาะ บ่งชี้ความแตกต่าง (restriction) ขนาดที่แตกต่างแยกด้วยกระแสไฟฟ้า (fragment length) เกิดแบบแผนด้วยตัวตรวจตาม (probe)

Restriction Fragment Length Polymorphisms (RFLP) Department of Biochemistry, Faculty of Science, Mahidol University Restriction Fragment Length Polymorphisms (RFLP)

ประโยชน์ของพันธุวิศวกรรม Department of Biochemistry, Faculty of Science, Mahidol University ประโยชน์ของพันธุวิศวกรรม ทางการแพทย์ ทางการเกษตร ทางด้านอุตสาหกรรม ทางสังคม

Department of Biochemistry, Faculty of Science, Mahidol University

Genetically modified organism (GMO) Department of Biochemistry, Faculty of Science, Mahidol University Genetically modified organism (GMO) สิ่งมีชีวิตที่สารพันธุกรรมหรือ ดีเอ็นเอถูกดัดแปลงไปด้วยวิธีที่ไม่ได้เกิดขึ้นตามธรรมชาติ ตามคำจัดกัดความขององค์การอนามัยโลก Transgenic mouse Golden rice

Department of Biochemistry, Faculty of Science, Mahidol University

เอกสารอ้างอิง ชีวเคมี, มนตรี จุฬาวัฒนฑล (2530/2542) Department of Biochemistry, Faculty of Science, Mahidol University เอกสารอ้างอิง ชีวเคมี, มนตรี จุฬาวัฒนฑล (2530/2542) ตำราชีวเคมี, พัชรี บุญศิริ (2551) Nelson DL and Cox MM. Lehninger: Principles of Biochemistry, 4th edition, 2005, W.H. Freeman and Company, New York, Voet D., Voet JG. and Pratt CW. Fundamentals of Biochemistry: Life at the Molecular Level, 3rd edition, 2008, John Wiley & Sons, New York http://www.sinauer.com/cooper/4e/animations04.html