การสร้าง in vivo Transcript จากโคลน cDNA เต็มสายของ เชื้อไวรัสใบด่างจุดวงแหวนมะละกอ (PRSV-P) สายพันธุ์ไทย (Construction of in vivo Full Length Transcripts of Papaya Ringspot Virus (PRSV) Type P Thai Strain) ผู้รับทุน: นางสาวชุติรัตน์ อัศวเทพ อาจารย์ที่ปรึกษา: รองศาสตราจารย์ ดร. วิชัย โฆสิตรัตน การโคลนจีโนมเต็มสายของเชื้อไวรัสใบด่างจุดวงแหวนมะละกอสายพันธุ์ ไทยจากการสังเคราะห์ cDNA ของเชื้อไวรัส PRSV-SMK5 ด้วยปฏิกิริยา RT-PCR ของจีโนมเป็นส่วนๆ โดยกำหนดให้แต่ละชิ้นซ้อนเหลื่อมกันทั้งจีโนม แล้วโคลน จีโนมของ PRSV-SMK5 เข้าพลาสมิด pCass2 ที่ใช้ในการแสดงออก โดยใช้การ โคลนนิ่งแบบต่อเนื่องเป็นลำดับ ได้โคลน cDNA เต็มสายของจีโนมเชื้อ PRSV- SMK5 จำนวนสองพลาสมิดให้ชื่อว่า pCF17_7 และ pCF17_8 พลาสมิดทั้งสอง โคลนทำให้มะละกอเกิดอาการโรคใบด่างจุดวงแหวนมะละกอหลังการปลูกเชื้อ ด้วยวิธีกล

การสังเคราะห์ cDNA และหาลำดับนิวคลีโอไทด์ของจีโนมของเชื้อไวรัส PRSV นำไอโซเลทของเชื้อไวรัสใบด่างจุดวงแหวนมะละกอจาก จ. สมุทรสาคร (PRSV-SMK) ได้แก่ PRSV-SMK5 มาใช้เป็นต้นแบบสำหรับการโคลนเพื่อสร้าง cDNA เต็มสายของจีโนมของเชื้อไวรัส PRSV โดยสังเคราะห์ดีเอ็นเอจำนวน 7 ชิ้น ได้แก่ F1 ถึง F7 ซึ่งครอบคลุมทั้งจีโนม ด้วยเทคนิคพีซีอาร์ ที่ใช้ไพรเมอร์ (ลูกศร) ที่ออกแบบจากตำแหน่งของเอนไซม์ตัดจำเพาะที่มีเพียงหนึ่งตำแหน่งบนจีโนม ดังภาพด้านล่าง นำผลผลิตที่ได้โคลนเข้าพลาสมิด pGEM®-T easy vector เพื่อส่งหาลำดับนิวคลีโอไทด์ เลือกหนึ่งโคลนจากแต่ละชิ้นย่อยของจีโนมมาใช้เป็นต้นแบบในการสร้าง infectious clone ต่อไป

การสร้างโคลนของ cDNA เต็มสายของเชื้อไวรัส PRSV สร้างขึ้นได้จากการต่อชิ้นย่อยของจีโนม PRSV-SMK5 เข้าด้วยกัน โดย การโคลนนิ่งแบบต่อเนื่องเป็นลำดับ เข้าสู่พลาสมิด pCass2 ซึ่งขับเคลื่อนการถอดรหัสของยีน (transcription) ด้วยชุดโปรโมเตอร์ Cauliflower mosaic virus 35S (CaMV 35S promoter) จำนวนสองชุด ต่อเนื่องกัน และหยุดการถอดรหัส ด้วย CaMV 35S terminator (CaMV_35S term) ได้เป็น in vivo infectious clone (pCF17) ที่มี cDNA เต็มสายของเชื้อไวรัส PRSV จำนวน 10,323 นิวคลีโอไทด์ (nts) ถอดรหัสได้เป็น polyprotein ขนาด 3,343 กรดอะมิโน ส่วน poly(A) 35 nts ส่วนที่ไม่ได้ถอดรหัสที่ปลาย 5ʹ 85 nts และที่ปลาย 3ʹ 206 nts ดังแสดงตามภาพด้านล่าง

ความสามารถในการทำให้เกิดโรคของ cDNA โคลนเต็ม สายของไอโซเลท PRSV-SMK5 ความสามารถในการทำให้เกิดโรคของ cDNA โคลนเต็ม สายของไอโซเลท PRSV-SMK5 สกัดพลาสมิด pCass2 (ตัวควบคุมลบ) pCF17_7 และ pCF17_8 ปลูกเชื้อ ด้วยพลาสมิดแต่ละชนิดๆ ลงมะละกอจำนวน 10 ต้น/กรรมวิธี ใช้ฟอสเฟต บัฟเฟอร์เป็นตัวควบคุมลบ และน้ำคั้นจากต้นมะละกอที่เป็นโรคจาก PRSV- SMK5 เป็นตัวควบคุมบวก หลังจากปลูกเชื้อ ตามภาพด้านล่าง (หลังปลูกเชื้อ 15 วัน (15 dpi) และ 28 วัน (28 dpi)) ตรวจสอบการถอดรหัสของโคลนด้วยการ สกัดอาร์เอ็นเอจากใบมะละกอที่ปลูกเชื้อ แล้วนำอาร์เอ็นเอที่ได้มาตรวจยีน CP โดยวิธี RT-PCR ตรวจสอบการแปลรหัสของยีน CP ด้วยวิธี ELISA และตรวจ ยืนยันการเกิดโรคโดยตรวจหาอนุภาคไวรัสด้วยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน โดยใช้เทคนิค immuno electron microscope

ความสามารถในการทำให้เกิดโรคของ cDNA โคลน เต็มสายของไอโซเลท PRSV-SMK5 (ต่อ) ต้นมะละกอทดสอบที่ปลูกเชื้อด้วยพลาสมิด pCF17_7 และ pCF17_8 ซึ่ง เป็นโคลนที่มี cDNA เต็มสายของ จีโนมเชื้อ PRSV-SMK5 แสดงอาการโรคใบด่างจุดวงแหวนหลังจากการ ปลูกเชื้อ โดยตรวจพบการถอดรหัสของอาร์เอ็นเอที่สังเคราะห์จากพลาส มิดด้วยเทคนิค RT-PCR ของยีน CP และพบการแปลรหัสของโปรตีนจาก อาร์เอ็นเอที่ถอดรหัสมาจากพลาสมิด เมื่อตรวจด้วย ELISA จากตัวอย่าง น้ำคั้นจากใบพืช ตามตารางด้านล่าง Inoculum ELISA (infected/Inoculated plant) (% infectivity) {Average of ELISA value} PCR of CP (Amplified /Inoculated) (% infectivity) 0 dpi 21 dpi 28 dpi Phosphate buffer, pH 7.0 0/10 (0%) {0.138} 0/10 (0%) {0.096} 0/10 (0%) {0.107} 0/10 (0%) Sap from PRSV-SMK5 infected papaya leaf 0/10 (0%) {0.160} 5/8 (62%) {0.255} 8/8 (100%) {1.044} 6/6 (100%) 40 µg of pCass2 0/10 (0%) {0.154} 0/10 (0%) {0.099} 0/10 (0%) {0.137} 40 µg of pCF17_7 0/10 (0%) {0.147} 7/10 (70%) {0.270} 8/10 (80.0%) {0.864} 8/10 (80%) 40 µg of pCF17_8 0/10 (0%) {0.144} 2/10 (20%) {0.147} 9/10 (90.0%) {0.401} 9/10 (90%) ตารางแสดงการทดสอบการเกิดโรคของโคลน cDNA เต็มสายของเชื้อไวรัส PRSV

ความสามารถในการทำให้เกิดโรคของ cDNA โคลนเต็มสายของไอโซเลท PRSV-SMK5 (ต่อ) ยืนยันอนุภาคท่อนยาวคดของ PRSV ด้วยการส่องกล้องจุลทรรศน์ อิเล็กตรอน พบอนุภาคไวรัสชนิดท่อนยาวคด (flexuous rod) ในตัวอย่าง น้ำคั้นพืชที่สุ่มมาจากต้นที่ปลูกเชื้อด้วย pCF17_7 และ pCF17_8 ซึ่งมีขนาด ความยาวประมาณ 700 nm X 10 nm ดังแสดงตามภาพด้านล่าง ขีดสีขาว เทียบได้กับขนาด 200 nm ภาพอนุภาคของเชื้อไวรัส PRSV ในน้ำคั้นพืชเมื่อตรวจยืนยันด้วยเทคนิค immuno electron microscopy