Luminescence Spectroscopy ภาควิชาเคมี คณะวิทยาศาสตร์ จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย Luminescence Spectroscopy ผศ.สุชาดา จูอนุวัฒนกุล

Luminescence Spectroscopy Molecular Fluorescence Spectroscopy Fluorescent Species Effect of Concentration Fluorescence Intensity Fluorescence Instruments Applications of Fluorescence Methods Molecular Phosphorescence Spectroscopy Chemiluminescence Methods

Luminescence Spectroscopy Photoluminescence เป็น emission process ที่เกิดจากอะตอมหรือโมเลกุลถูกกระตุ้นโดยการดูดกลืนรังสีแม่เหล็กไฟฟ้า แล้วกลับสู่ ground state โดยปล่อยพลังงานส่วนเกินในรูปของโฟตอน ถ้า emission process เกิดขึ้นเกือบทันที ใช้เวลา 10-5 วินาที หรือน้อยกว่า เรียกว่า การวาวแสง หรือ ฟลูออเรสเซนซ์ (fluorescence) และถ้า emission process ใช้เวลาในการเกิดมาก เป็นนาทีหรือชั่วโมง เรียกว่า การเรืองแสง หรือ ฟอสฟอเรสเซนซ์ (phosphorescence) fluorescence ใช้ในการวิเคราะห์ทางเคมีมากกว่า phosphorescence

Luminescence Spectroscopy Chemiluminescence เป็น emission process ที่เกิดจากอะตอมหรือโมเลกุลถูกกระตุ้นโดยปฏิกิริยาเคมี แล้วกลับสู่ ground state โดยปล่อยพลังงานส่วนเกินในรูปของโฟตอน ในบางกรณี อะตอมหรือโมเลกุลที่ถูกกระตุ้นเป็นผลิตภัณฑ์ของปฏิกิริยาระหว่าง analyte กับรีเอเจนต์ที่เหมาะสม (โดยปกติใช้ strong oxidant เช่น ozone หรือ peroxide) สเปกตรัมที่ได้จึงเกิดจากการปล่อยพลังงานของผลิตภัณฑ์ ไม่ใช่ของ analyte เอง นอกจากนี้ analyte อาจไม่เกี่ยวข้องใน chemiluminescent reaction โดยตรง แต่เร่งหรือยับยั้งการเกิด chemiluminescence ในที่นี้ส่วนใหญ่จะกล่าวถึง molecular fluorescence

Luminescence Spectroscopy ข้อดีของ luminescence methods เมื่อเทียบกับ absorption methods sensitivity สูงกว่า 1-3 เท่า (detection limit ต่ำกว่า 1-3 เท่า) linear concentration range กว้างกว่า selectivity  absorption methods อย่างไรก็ดี luminescence methods ใช้กันไม่กว้างขวางนัก เพราะ chemical systems ที่ให้ luminescence มีจำกัด

Molecular Fluorescence Spectroscopy molecular fluorescence spectroscopy ทำโดยการกระตุ้นตัวอย่างด้วยรังสีที่ความยาวคลื่นที่เกิดการดูดกลืน เรียกว่า absorption หรือ excitation wavelength และวัดรังสีที่เปล่งออกมาที่ความยาวคลื่นซึ่งเรียกว่า emission wavelength เช่น ควินิน (quinine) สามารถดูดกลืนรังสีที่ 350 nm และให้ฟลูออเรสเซนซ์โดยปล่อยพลังงานสูงสุดที่ความยาวคลื่น 460 nm

Molecular Fluorescence Spectroscopy รูปที่ 1 Excitation และ emission spectrum ของควินิน

รูปที่ 2 Energy-Level Diagrams for Photoluminescent Molecules vibrational relaxation (10-13 s) internal conversion (10-6 - 10-9 s) S2 S1 S0 T1 Energy รูปที่ 2 Energy-Level Diagrams for Photoluminescent Molecules S0 - ground electronic singlet state S1, S2 - first and second excited electronic singlet state T1 - first excited electronic triplet state absorption (10-14-10-15s) 2 1 Intersystem crossing fluorescence 3 Internal conversion external conversion Phospho- rescence (10- 4 - 10 s) 4

Molecular Fluorescence Spectroscopy molecular fluorescence bands ส่วนใหญ่ประกอบด้วย lines ที่มีความยาวคลื่นมากกว่าความยาวคลื่นของรังสีที่ถูกดูดกลืนเพื่อให้เกิด excitation เรียกการเลื่อนที่ของความยาวคลื่นนี้ว่า Stokes shift เนื่องจากผลต่างของพลังงานระหว่าง vibrational states ทั้งใน ground และ excited states มีค่าใกล้เคียงกัน absorption spectrum หรือ excitation spectrum และ fluorescence spectrum ของสารประกอบจึงอาจมีลักษณะเป็น mirror images ของกันและกัน (ดังรูปที่ 3) และซ้อนกันที่ความยาวคลื่นที่สอดคล้องกับการเปลี่ยนระดับพลังงานระหว่าง vibrational level 0 ของ E1 กับ vibrational level 0 ของ E0

Molecular Fluorescence Spectroscopy รูปที่ 3 Excitation และ emission spectrum ของสาร ซึ่งมีลักษณะเป็น mirror images กัน

Fluorescent Species จากรูปที่ 3 จะเห็นได้ว่าฟลูออเรสเซนซ์เป็นกระบวนการหนึ่งในหลายกระบวนการ ที่โมเลกุลกลับสู่ ground state หลังจากที่ถูกกระตุ้นโดยการดูดกลืนรังสี โมเลกุลที่ดูดกลืนรังสีได้ทุกชนิดจึงมีโอกาสที่จะให้ฟลูออเรสเซนซ์ได้ แต่โมเลกุลส่วนใหญ่ไม่ให้ฟลูออเรสเซนซ์ เนื่องจากโครงสร้างของโมเลกุลเหล่านี้ทำให้ radiationless relaxation เกิดขึ้นด้วยอัตราที่สูงกว่า fluorescence emission โมเลกุลจะมีประสิทธิภาพเชิงควอนตัม (quantum efficiency) ในการให้ฟลูออเรสเซนซ์มากน้อยเพียงใด อธิบายได้ด้วย ผลได้เชิงควอนตัม (quantum yield)

Fluorescent Species quantum yield ของ molecular fluorescence (F) = kF = ค่าคงที่อัตราเร็วของ fluorescence relaxation knr = ค่าคงที่อัตราเร็วของ nonradiative relaxation จำนวนโมเลกุลที่ให้ฟลูออเรสเซนซ์ จำนวนโมเลกุลที่ถูกกระตุ้น จำนวนโฟตอนที่ถูกคายออกมา จำนวนโฟตอนที่ถูกดูดกลืน kF kF + knr

Fluorescent Species  โมเลกุลที่ให้ฟลูออเรสเซนซ์ได้ดี เช่น ฟลูออเรสซีน (fluorescein) มี quantum yield ใกล้เคียง 1  สารที่ไม่ให้ฟลูออเรสเซนซ์มี quantum yield = 0

Fluorescent Species Fluorescence and Structure สารประกอบที่ให้ฟลูออเรสเซนซ์ส่วนใหญ่มี aromatic rings aliphatic และ alicyclic carbonyl compounds บางชนิดโดย เฉพาะอย่างยิ่ง เมื่อมี conjugate double-bonds ให้ฟลูออเรสเซนซ์ได้ unsubstituted aromatic hydrocarbons ในสารละลายให้ฟลูออเรสเซนซ์ และ quantum efficiency เพิ่มขึ้นเมื่อจำนวน rings และ degree of condensation เพิ่มขึ้น

Fluorescent Species heterocyclic compounds อย่างง่าย ไม่ให้ฟลูออเรสเซนซ์ เช่น pyridine furan thiophene pyrrole แต่ fused-ring structures ที่มี rings เหล่านี้ ให้ฟลูออเรสเซนซ์ quinoline isoquinoline indole N O S H H N

Fluorescent Species การแทนที่บน aromatic rings ทำให้เกิด  การเลื่อนที่ของความยาวคลื่นที่มีการดูดกลืนสูงสุด  การเปลี่ยนแปลงของ fluorescence peaks  การเปลี่ยนแปลง fluorescence efficiency (ดูตารางที่ )

Fluorescent Species ตารางที่ 1 ผลของการแทนที่บน benzene rings ต่อฟลูออเรสเซนซ์ สารประกอบ สูตร ความยาวคลื่นของ fluorescence Intensity ของ fluorescence benzene C6H6 270-310 10 toluene C6H5CH3 270-320 17 propylbenzene C6H5C3H7 fluorobenzene C6H5F chlorobenzene C6H5Cl 275-345 7 bromobenzene C6H5Br 290-380 5 iodobenzene C6H5I - phenol C6H5OH 285-365 18 phenolate ion C6H5O- 310-400

Fluorescent Species Effect of Structural Rigidity จากการทดลองพบว่า rigid molecule ให้ฟลูออเรสเซนซ์ได้ดี โดย rigidity จะลดอัตราการเกิด nonradiative relaxation ลงจนถึงจุดที่เกิด relaxation โดยฟลูออเรสเซนซ์ เช่น  fluorescing dyes ที่ถูกดูดซับบนพื้นผิวของของแข็ง จะให้ฟลูออเรสเซนซ์ได้เพิ่มขึ้น เนื่องจากการดูดซับของของแข็งทำให้ rigidity เพิ่มขึ้น

รูปที่ 4 ผลของ rigidity ต่อ quantum yield. Fluorescent Species  fluorene (ซึ่งโมเลกุล rigid เนื่องจากมี methylene group ยึด benzene rings ทั้งสองไว้) มี quantum efficiency ใกล้เคียง 1 ส่วน biphenyl (ซึ่ง benzene rings ในโมเลกุลหมุนได้อย่างอิสระ) มี quantum efficiency เท่ากับ 0.2 fluorene biphenyl  1  = 0.2 รูปที่ 4 ผลของ rigidity ต่อ quantum yield.

Fluorescent Species  Zn–(8-hydroxyquinoline) complex (หรือ chelate) ให้ฟลูออเรสเซนซ์ที่มีความเข้ม (intensity) สูงกว่า 8-hydroxyquinoline (ซึ่งเป็นสารอินทรีย์ก่อคีเลต) มาก เนื่องจากคีเลตมี rigidity สูงกว่า 8-hydroxyquinoline N OH 8-hydroxyquinoline (nonfluorescing) O Zn 2 รูปที่ 5 ผลของ rigidity ต่อ quantum yield ของสารเชิงซ้อน Zn-8-hydroxyquinoline complex (fluorescing)

Fluorescent Species Temperature and Solvent Effects Quantum efficiency ของฟลูออเรสเซนซ์จะลดลง เมื่ออุณหภูมิเพิ่มขึ้น เนื่องจากที่อุณหภูมิ ความถี่ของการชนกันของโมเลกุลจะเพิ่มขึ้น ทำให้เกิด nonradiative relaxation ได้มากขึ้น Quantum efficiency ของฟลูออเรสเซนซ์จะลดลง เมื่อความหนืด (viscosity) ของตัวทำละลายลดลง ทำให้ความถี่ของการชนกันของโมเลกุลเพิ่มขึ้น และเกิด nonradiative relaxation ได้มากขึ้น

Effect of Concentration of Fluorescence Intensity กำลังของ fluorescence radiation (F) เป็นสัดส่วนกับกำลังการแผ่รังสี (radiant power) ของ excitation beam ที่ถูกดูดกลืน F = K (P0 - P) (1) P0 = กำลังของลำแสงที่ตกกระทบสารละลาย K  = ค่าคงที่ ซึ่งขึ้นกับ quantum efficiency ของ fluorescence เพื่อแสดงความสัมพันธ์ของ F กับความเข้มข้น c ของ fluorescing species เขียน Beer’s law ในรูป P/P0 = 10-bc หรือ P = P0 x 10-bc (2)  = molar absorptivity of fluorescing species bc = absorbance (A)

Effect of Concentration of Fluorescence Intensity แทนค่า P จากสมการ (2) ลงในสมการ (1) F = K  P0 (1 - 10-bc) (3) F = K  P0 2.3bc – – – … (4) เมื่อ bc (A) < 0.05; 2.3bc จะมีค่ามากกว่าเทอมอื่นๆในวงเล็บมาก ดังนั้น F = 2.3K bc P0 (5) เมื่อกำลังของรังสีตกกระทบมีค่าคงที่ จะได้ F = K c (6) ดังนั้นถ้า plot fluorescence power ของสารละลาย กับ ความเข้มข้นของสารละลาย จะได้เส้นตรงที่ความเข้มข้นต่ำ (–2.3bc)2 2 (–2.3bc)3 3

Effect of Concentration of Fluorescence Intensity เมื่อ c มีค่ามากขึ้นจน A มากกว่า 0.05 (หรือ T น้อยกว่า 0.9) ความสัมพันธ์ระหว่าง F และ c ดังสมการ (6) จะไม่เป็นเส้นตรง และ F อยู่ต่ำกว่าแนวเส้นตรงที่ลากต่อออกมา ซึ่งเป็นผลของ primary absorption ซึ่งรังสีตกกระทบถูกดูดกลืนได้มากจนให้ฟลูออเรสเซนซ์ไม่เป็นสัดส่วนกับความเข้มข้น ดังสมการ (4) ที่ความเข้มข้นสูงมาก F จะมีค่าสูงสุดและเริ่มลดลงเมื่อเพิ่มความเข้มข้นเนื่องจาก secondary absorption ซึ่งฟลูออเรสเซนซ์ที่เปล่งออกมาถูกดูดกลืนโดยโมเลกุลของ analyte โมเลกุลอื่นๆ

Effect of Concentration of Fluorescence Intensity รูปที่ 4 Calibration curve สำหรับการหาปริมาณ tryptophan ในโปรตีนที่ละลายน้ำได้จากเลนส์ของตามนุษย์ 100 Relative fluorescence power, F ความเข้มข้น , M x 107

Effect of Concentration of Fluorescence Intensity นอกจากนี้ primary และ secondary absorption effects ซึ่งบางครั้งเรียกว่า inner-filter effects นี้ อาจเกิดจากการดูดกลืนโดยโมเลกุลใน sample matrix

Fluorescence Instruments

Fluorescence Instruments รูปที่ 5 ส่วนประกอบของ fluorometer/spectrofluorometer. Source primary excitation filter/ monochromator Sample secondary emission filter/ Beam attenuator Readout Difference Amplifier Reference PMT

Fluorescence Instruments รูปที่ 5 แสดงส่วนประกอบของ fluorometers และ spectrofluorometers ส่วนประกอบเหล่านี้เหมือนส่วนประกอบในเครื่องมือสำหรับใน UV/visible spectroscopy fluorescence instrument โดยทั่วไปเป็น double-beam optics เพื่อหักล้างการเปลี่ยนแปลง power ของ source เมื่อผ่านรังสีไปยังตัวอย่าง เริ่มแรกรังสีจะผ่าน primary excitation filter/monochromator ซึ่งส่งผ่านรังสีที่จะทำให้เกิด excitation แต่แยก emitted radiation ซึ่งมีความยาวคลื่นเท่ากับฟลูออเรสเซนซ์ออกไป fluorescence radiation จะเปล่งออกจากตัวอย่างทุกทิศทาง แต่การวัดทำได้สะดวกที่สุดในแนวตั้งฉากกับ excitation beam ที่มุมอื่นๆ การกระเจิงแสงที่เกิดจากสารละลาย

Fluorescence Instruments และผนังเซลล์อาจเพิ่มขึ้น ทำให้เกิดความคลาดเคลื่อนในการวัด intensity มากกว่า emitted radiation จะเข้าสู่ photoelectric detector หลังจากผ่าน secondary emission filter/ monochromator ซึ่งแยก fluorescence peak สำหรับการวัด

Fluorescence Instruments fluorescence instrument โดยทั่วไปเป็น double-beam optics เพื่อหักล้างการเปลี่ยนแปลง power ของ source เมื่อผ่านรังสีไปยังตัวอย่าง เริ่มแรกรังสีจะผ่าน primary excitation filter/monochromator ซึ่งส่งผ่านรังสีที่จะทำให้เกิด excitation แต่แยก emitted radiation ซึ่งมีความยาวคลื่นเท่ากับฟลูออเรสเซนซ์ออกไป fluorescence radiation จะเปล่งออกจากตัวอย่างทุกทิศทาง แต่การวัดทำได้สะดวกที่สุดในแนวตั้งฉากกับ excitation beam ที่มุมอื่นๆ การกระเจิงแสงที่เกิดจากสารละลายและผนังเซลล์อาจเพิ่มขึ้น ทำให้เกิดความคลาดเคลื่อนในการวัด intensity มากกว่า emitted radiation จะเข้าสู่ photoelectric detector หลังจากผ่าน secondary emission filter/ monochromator ซึ่งแยก fluorescence peak สำหรับการวัด

Fluorescence Instruments Radiation Sources fluorescence ต้องใช้ source ที่มี intensity สูงกว่า tungsten หรือ hydrogen lamp ที่ใช้วัด absorption เนื่องจาก F = 2.303K  P0bc นั่นคือ emitted radiation power (และ sensitivity) เป็นสัดส่วนโดยตรงกับ source power (P0) ในขณะที่ absorbance คือ log P0/P จึงไม่ขึ้นกับ source power fluorescence source ที่ใช้กันทั่วไปได้แก่  mercury arc lamps  xenon arc lamps  xenon-mercury arc lamps  lasers

Fluorescence Instruments Wavelength Selectors เครื่องมือที่ wavelength selectors ทั้งสองเป็น filters เรียกว่า fluorometer ถ้า wavelength selectors ทั้งสองเป็น monochromatorsเรียกว่า spectrofluorometer spectrofluorometer บางชนิดใช้ filter สำหรับเลือกความยาวคลื่นของ excitation radiation และใช้ grating monochromator สำหรับกระจาย fluorescence radiation Fluorescence filter

Fluorescence Instruments Cells and Cell Compartments การวัดฟลูออเรสเซนซ์ใช้ cylindrical และ rectangular cells ที่ทำด้วยแก้วหรือซิลิกา การออกแบบ cell compartment ต้องระวังเพื่อลดปริมาณ scattered radiation ที่เข้าสู่ detector จึงมักมี baffles ใน cell compartment

Fluorescence Instruments Detectors ส่วนใหญ่ใช้ photomultiplier (PMT) โดยทั่วไป fluorescene signal มี intensity ต่ำ จึงต้องการ amplification factors สูง detectors ที่ใช้กันมากคือ photomultiplier (PMT) และมีการใช้ diode array detectors ใน spectrofluorometer

Fluorescence Instruments fluorometers และ spectrofluorometers ต่างกันอย่างกว้างขวางในแง่ของความซับซ้อน สมรรถนะ และราคา เช่นเดียวกับ absorption spectrophotometers โดยทั่วไป fluorescence instruments จะมีราคาแพงกว่า absorption instruments ที่มีคุณภาพในระดับเดียวกัน

Fluorescence Instruments รูปที่ 6 Optical diagram ของ spectrofluorometer

Applications of Fluorescence Methods fluorescence spectroscopy ไม่ค่อยใช้สำหรับการวิเคราะห์โครงสร้างของสาร (structural analysis) หรือการวิเคราะห์คุณภาพ (qualitative analysis) เพราะโมเลกุลที่มีโครงสร้างต่างกันอาจให้ fluorescence spectra คล้ายกัน นอกจากนี้ fluorescence bands ของสารละลายจะค่อนข้างกว้าง (board) ที่อุณหภูมิห้อง fluorescence methods สามารถประยุกต์กับสารละลายที่มีความเข้มข้นต่ำกว่า absorption methods จึงเป็นวิธีที่มี sensitivity สูง เนื่องจาก power ของ fluorescence (F) สัมพันธ์กับความเข้มข้นและ power ของ source (F = 2.3K bc P0) การเพิ่ม sensitivity ของ fluorescence methods ทำได้โดยการเพิ่ม P0 หรือการขยาย fluorescence signal

Applications of Fluorescence Methods สำหรับ absorption methods ค่า absorbance ซึ่งแปรผันโดยตรงกับความเข้มข้น เท่ากับ log P0/P ถ้าเพิ่ม P0 จะทำให้ P เพิ่มขึ้นในอัตราส่วนเดียวกัน จึงไม่มีผลต่อ absorbance และไม่เพิ่ม sensitivity ในทำนองเดียวกันการขยายสัญญาณจาก detector จะทำให้ทั้ง P และ P0 เพิ่มขึ้นเท่ากัน absorbance จึงไม่เพิ่มขึ้น โดยทั่วไป fluorescence methods มี sensitivity สูงกว่า absorption methods 1-3 เท่า

Applications of Fluorescence Methods ความแม่น (accuracy) และความเที่ยง (precision) ของ fluorescence methods มักต่ำกว่า absorption methods ด้วยแฟกเตอร์ 2-5 และ phosphorescence methods มี precision ต่ำกว่า fluorescence methods fluorescence methods ใช้หาปริมาณ inorganic, organic และ biochemical species ศึกษาสมดุลเคมีและจลนพลศาสตร์ได้เช่นเดียวกับ absorption methods โดยสามารถใช้กับปฏิกิริยาเคมีที่ความเข้มข้นต่ำกว่า เพราะมี sensitivity สูงกว่า absorption methods

Applications of Fluorescence Methods Methods for Inorganic Species มี 2 วิธี คือ 1. Direct Methods ให้ analyte ทำปฏิกิริยากับ complexing agent เพื่อให้เกิด fluorescent complex แล้ววัด fluorescence 2. Indirect Methods วัดการลดลงของ fluorescence ที่เรียกว่า quenching ซึ่งเกิดขึ้นเมื่อ analyte ทำปฏิกิริยากับ fluorescent reagent ส่วนใหญ่ quenching ใช้สำหรับการหาปริมาณของไอออนลบ (anions) และ ออกซิเจนที่ละลายอยู่ (dissolved oxygen)

Applications of Fluorescence Methods การหาปริมาณ metal ions transition metals ส่วนใหญ่ดูดกลืนรังสีในช่วง UV/visible แต่ transition-metals chelates มักไม่ให้ fluorescence เนื่องจากเกิด nonradiative relaxation ได้ดี nontransition-metal ions ไม่ดูดกลืนรังสีในช่วง UV/visible แต่ nontransition-metal chelates ให้ fluorescence ดังนั้น ในการหาปริมาณ metal ions จึงใช้ fluorescence methods เสริมกับ absorption methods

Applications of Fluorescence Methods fluorometric reagents สำหรับการวิเคราะห์แคตไอออน ที่ใช้ได้ผลดีที่สุดคือรีเอเจนต์ที่มี aromatic structures และมีอะตอมที่ให้คู่อิเล็กตรอน 2 อะตอมขึ้นไป ซึ่งทำให้เกิด chelate กับ metal ions เช่น  8-hydroxyquinoline (รีเอเจนต์สำหรับ Al, Be, และ metal ions อื่นๆ)  flavanol (รีเอเจนต์สำหรับ Zr and Sn)  alizarin garnet R (รีเอเจนต์สำหรับ Al, F-)  benzoin (รีเอเจนต์สำหรับ B, Zn, Ge, และ Si)

Applications of Fluorescence Methods ตารางที่ 2 Selected Fluorescence Methods for Inorganic Species Ion Reagent Wavelength, nm Sensitivity g/mL Absorption Fluorescence Al3+ alizarin garnet R 470 500 10.007 F- Al complex ของ alizarin garnet R (quenching) 0.001 B4O72- Benzoin 370 450 0.04 Cd2+ 2-(o-Hydroxyphenyl)-benzoxazole 365 Blue 2 Li+ 8-hydroxyquinoline 580 0.2 Sn4+ Flavanol 400 0.1 Zn2+ -- Green 10

Applications of Fluorescence Methods Methods for Organic and Biochemical Species fluorescence methods สามารถใช้กับ organic และbiochemical substance จำนวนมาก ได้แก่ amino acids, proteins, coenzymes, vitamins, nucleic acids, alkaloids, porphyrins, steroids, flavanoids และ metabolites ส่วนใหญ่ใช้ในการวิเคราะห์อาหาร ยา ตัวอย่างทางคลินิก และผลิตภัณฑ์ธรรมชาติ เนื่องจาก fluorescence methods มี sensitivity สูง จึงใช้ในการตรวจวัดสำหรับ liquid chromatographic methods, flow analysis methods และ electrophoresis

Molecular Phosphorescence Spectroscopy โมเลกุลจำนวนมากสามารถเกิด delayed emission หรือ phosphorescence ได้ emission นี้วัดได้ที่มุมฉากกับลำรังสีที่ใช้กระตุ้นเช่นเดียวกับ fluorescence ช่วงเวลาสำหรับการเปล่ง phosphorescence จากโมเลกุลคือ 10-4 - 104 s ดังนั้นจะเกิด phosphorescence ได้เฉพาะใน rigid solvent structures ซึ่งจะเกิด collisional deactivation น้อยที่สุด โดยทั่วไปจะพบ phosphorescence ได้ที่อุณหภูมิของ liquid nitrogen

Molecular Phosphorescence Spectroscopy Electron Spins แต่ละอะตอมในโมเลกุลมีสนามแม่เหล็ก ซึ่งเกิดจากการหมุนรอบแกนของอิเล็กตรอน โดยถือว่ามี 2 quantized spin state เท่านั้นที่เป็นไปได้ ทิศทางการหมุนและทิศทางของสนามแม่เหล็กที่เกิดขึ้นในแต่ละ spin state มีทิศทางตรงกันข้าม 2 quantized spin state of electron

Molecular Phosphorescence Spectroscopy ใน molecular orbital ที่มี 2 อิเล็กตรอน spin ของอิเล็กตรอนทั้งสองจะตรงกันข้ามตาม Pauli Exclusion Principle หรือ spin pairing เรียกว่าอิเล็กตรอนอยู่ใน ground singlet state โมเลกุลที่อิเล็กตรอนทุกตัวมี spin pairing จะไม่มีสนามแม่เหล็กสุทธิ จึงเป็น diamagnetic ซึ่งจะผลักกับสนามแม่เหล็กถาวร เมื่ออิเล็กตรอนถูกกระตุ้นไปยังระดับพลังงานสูงขึ้น ถ้า spin ของ excited-state electron ตรงกันข้ามกับ ground-state electron (spin pairing) เรียกว่าอิเล็กตรอนอยู่ใน excited singlet state แต่ถ้า spin ของ excited-state electron เหมือนกับ ground-state electron เรียกว่าอิเล็กตรอนอยู่ใน excited triplet state โดย excited triplet state มีพลังงานน้อยกว่า excited singlet state ชื่อ singlet, doublet และ triplet มาจาก spectroscopic multiplicity consideration ซึ่งจะไม่พิจารณาถึงในที่นี้

Molecular Phosphorescence Spectroscopy ground singlet state diamagnetic excited triplet state paramagnetic

Molecular Phosphorescence Spectroscopy Molecular fluorescence เกิดขึ้นเมื่อมี electronic transition จาก excited singlet state ไปยัง ground singlet state transition นี้มีความเป็นไปได้สูง ดังนั้น lifetime ของ excited singlet state สั้นมาก (10-5 s หรือน้อยกว่า) Molecular phosphorescence เกิดขึ้นเมื่อมี electronic transition จาก excited triplet state ไปยัง ground singlet state เนื่องจาก transition นี้มีการเปลี่ยน electron spin จึงมีความเป็นไปได้น้อยกว่า lifetime ของ excited triplet state จึงยาวกว่า (10-4 - 104 s)

Molecular Phosphorescence Spectroscopy เนื่องจาก phosphorescence มี lifetime ยาว โมเลกุลใน excited state บางส่วนจึงอาจเกิด nonradiative relaxation ทำให้ประสิทธิภาพของ phosphorescence process และ phosphorescence intensity ค่อนข้างต่ำ โดยทั่วไปจึงวัด phosphorescence ที่อุณหภูมิต่ำ ในตัวกลางที่ rigid เช่น แก้ว เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพ เมื่อไม่นานมานี้ phosphorescence ที่อุณหภูมิห้องได้รับความนิยมมากขึ้น ในเทคนิคนี้โมเลกุลจะถูกดูดซับบนพื้นผิวของแข็ง หรืออยู่ใน molecular cavity

Molecular Phosphorescence Spectroscopy phosphorimetry ใช้ในการหาปริมาณ organic และ biochemical species ต่างๆจำนวนมาก เช่น nucleic acids, amino acids, pyrine, pyrimidine, enzymes, petroleum hydrocarbons, pesticides แต่วิธีนี้ไม่เป็นที่นิยมใช้กันอย่างกว้างขวางเหมือน fluorometry เนื่องจากต้องใช้อุณหภูมิต่ำ และการวัด phosphorescence มี precision ต่ำกว่า ในทางตรงกันข้าม phosphorescence ให้ selectivity สูงกว่า

Chemiluminescence Methods chemiluminescence เกิดขึ้นเมื่อปฏิกิริยาเคมีทำให้เกิด eletronic excited molecule ซึ่งจะคายรังสีเมื่อกลับสู่ ground state chemiluminescence reactions ส่วนหนึ่งพบในระบบชีวภาพ กระบวนการที่เกิดขึ้นมักเรียกว่า bioluminescence เช่น หิ่งห้อย แมงกระพรุนบางชนิด แบคทีเรีย โปรโตซัว และ crustacea chemiluminescence ใช้เครื่องมือที่ง่าย เนื่องจากไม่ต้องใช้ external source สำหรับ excitation และไม่ต้องใช้ wavelength selector เครื่องมือจะประกอบด้วย reaction vessel และ photomultiplier tube เท่านั้น

Chemiluminescence Methods chemiluminescence ให้ sensitivity สูง โดยทั่วไป detection limits จะอยู่ในช่วง parts per million (ppm) ถึง parts per billion (ppb) หรือต่ำกว่า