โครงการการใช้ดีเอ็นเอกำกับลักษณะพันธุ์ไม้ไทย

งานนำเสนอเรื่อง: "โครงการการใช้ดีเอ็นเอกำกับลักษณะพันธุ์ไม้ไทย"— ใบสำเนางานนำเสนอ:

1 โครงการการใช้ดีเอ็นเอกำกับลักษณะพันธุ์ไม้ไทย
: เรื่องการศึกษาความหลากหลายพันธุกรรมฝรั่งพื้นบ้านและพันธุ์การค้า

2 1. เตรียม DNA จากใบพืช ดีเอ็นเอ

3 2. เพิ่มปริมาณ DNA ในหลอดทดลองโดยเทคนิควิธี RAPD และ AFLP
โดยปฎิกิริยา PCR (Polymerase Chain Reaction)

4 เทคนิค AFLP เทคนิค RAPD
ดีเอ็นเอ เทคนิค AFLP เทคนิค RAPD DNA Denture 91.50C, 1 min. PCR 1 20 รอบ ตัดดีเอ็นเอพืชด้วยเอนไซมส์ในตำแหน่งจำเพาะเกก่อนแล้วจึง ใช้ดีเอ็นเอสายสั้นมาสุ่มเข้าคู่ ก่อนเพิ่มปริมาณปฏิกิริยา PCR ใช้ดีเอ็นเอสายสั้น สุ่มเข้าคู่กับดีเอ็นเอของพืชแล้วจึงเพิ่มปริมาณโดยปฏิกิริยา PCR Extension 720C, 2 min. PCR 45 รอบ PCR 2 30 รอบ Primer Annealing 360C, 1 min. เปฏิกิริยา PCR 1 ng/ul plant DNA (total DNA) 1 Buffer 0.1 mM dNTPs0.6 uM Primer 0.02 unit/ul Taq DNA polymerase 6 mM MgCl, Gel analysis Gel analysis

5 3. วิเคราะห์ผลลายพิมพ์ดีเอ็นเอ (RAPD และ AFLP- markers) ของฝรั่ง
ตัวอย่างลายพิมพ์ดีเอ็นเอ (RAPD- markers ) ของฝรั่ง 16 สายต้น

6 Marker GV1 GV6 GV7 GV4 GV2 GV16 GV8 GV9 GV10 GV11 GV12 GV13 GV14 GV15 GV3 GV5 กลมสาลี่ แป้นสีทอง สาลี่สีทอง แป้นยักษ์ เย็นสอง

7 Marker GV1 GV6 GV7 GV4 GV2 GV16 GV8 GV9 GV10 GV11 GV12 GV13 GV14 GV15 GV19 GV5 กลมสาลี่ แป้นสีทอง สาลี่สีทอง แป้นยักษ์ ขี้นก

8 ใช้ ไพรเมอร์ 13 ชนิดสามารถแยกแยกความแตกต่างระหว่างพันธุ์ 27 พันธุ์
กลมสาลี่ 2 แป้นสีทอง 5 แป้นสีทอง 6 แป้นสีทอง 7 แป้นยักษ์ 12 แป้นยักษ์ 13 สาลี่สีทอง 8 สาลี่สีทอง 11 สาลี่สีทอง 9 สาลี่สีทอง 10 แป้นยักษ์ 14 แป้นยักษ์ 15 ขี้นกไส้ขาว 25 ขี้นกไส้ขาว 26 ขี้นกไส้ขาว 29 ขี้นกไส้ขาว 27 ขี้นกไส้ขาว 28 กลมสาลี่ 3 แป้นสีทอง 4 ขี้นกไส้แดง 22 ขี้นกไส้แดง 23 ขี้นกไส้ขาว 24 ขี้นกไส้ขาว 17 ขี้นกไส้ขาว 18 ขี้นกไส้ขาว 19 ขี้นกไส้ขาว 20 ขี้นกไส้แดง 21 ใช้ ไพรเมอร์ 13 ชนิดสามารถแยกแยกความแตกต่างระหว่างพันธุ์ 27 พันธุ์ แล้ววิเคราะห์ความสัมพันธ์จาก ความเหมือนและไม่เหมือน ของ ลายพิมพ์ดีเอ็นเอ

9 4. ขั้นตอนและวิธีการปฏิกิริยา AFLP (Amplified Fragment Length Polymprphism)
ลำดับของไพรเมอร์จำนวน 13 หมายเลข ที่ใช้ในการคัดเลือกไพรเมอร์ที่เหมาะสมในการ จำแนกสายพันธุ์ฝรั่ง หมายเลข รหัสไพรเมอร์ หมายเลข รหัสไพรเมอร์ OPE OPE-15 OPE OPE-16 OPE OPE-17 OPE OPE-18 OPE OPE-08 OPE OPE-11 OPE-14

10 1. การเตรียมดีเอ็นเอ 1) ใช้ใบอ่อนของพืชมาสกัดดีเอ็นเอ ตามวิธีกรเดียวกันกับที่ใช้ RAPD ดังกล่าวข้างต้น แล้วปรับปริมาตรที่สกัดได้ทั้งหมดให้ได้ปริมาณ 100 ul. ในสารละลาย TE buffer 2) ปรับให้ได้ความเข้มข้น DNA 200 ng/ul (ใช้ DNA ที่สกัดได้จากข้อ 1 ประมาณ 2 ul 3) นำดีเอ็นเอเข้มข้น 200 ng/ul มาเตรียมทำปฏิกิริยาการเพิ่มดีเอ็นเอด้วยเทคนิค AFLP 2. ปฏิกิริยา AFLP 2.1 Digestion : ทำการตัดชิ้นส่วนของดีเอ็นเอด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะ 2 ชนิด ได้แก่ EcoRl และ Tru9l ด้วยส่วนประกอบของปฏิกิริยาดังนี้ DNA (200 ng/ul) 2 ul Tru9l (10 u/ul) 0.5 ul 10xBuffer A 2 ul dH2O 15 ul EcoRl (10 u/ul) ul ได้ปริมาตรรวมทั้งสิ้น 20 ul นำส่วนผสมทั้งหมดบ่มที่อุณหภูมิ 34 องศาเซลเซียส 2 ชั่วโมง

11 2.2 Ligation : ทำการเชื่อมชิ้นส่วนของดีเอ็นเอด้วย Adaptor ด้วยส่วนประกอบ
ของปฏิกิริยาดังนี้ 10x ligase buffer 1 ul dH2O ul ER Adaptor (5 pmol/ul) 1 ul T4 DNA Ligase (1 u/ul) ul MS Adaptor (50 pmol/ul) 1 ul ได้ปริมาตรรวม 10 ul - ใช้ปริมาตรทั้งหมดผสมลงใจส่วนผสมของ digestion อีก 20 ul ได้ปริมาตรรวม 30 ul. - บ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส 4 ชั่วโมง - หลังจากนั้นนำมาเช็คผลใน 1% Agarose gel (0.5% TBE buffer) โดยใช้ DNA จากขั้นตอนดังกล่าว 5 ul. ผสมกับ dyn 5 ul. ดังผลการตรวจสอบในภาพที่ 5 - นำมาเจือจางด้วยน้ำกลั่นที่นึ่งฆ่าเชื้อแล้ว 10 เท่า (225 ul.) ก่อนทำปฏิกิริยา PCR 2 ขั้นตอน ได้แก่ PCR I และ PCR II

12 2.3 PCR : ทำการเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอในขั้นตอนที่ 1 เช่นเดียวกับปฏิกิริยา RAPD
ของปฏิกิริยาดังนี้ DNA (จากช่วง ligation ที่เจือจางแล้ว 10 เท่า) 10 ul 10x PCR Buffer ul dNTP (1 mM) ul ER-A-Primer (75 ng/ul) ul Ms-C-Primer (75 ng/ul) ul Taq DNA Polymerase (5u/ul) ul ปริมาตรรวม ul - นำส่วนผสมไปทำให้เกิดปฏิกิริยาด้วยเครื่อง PCR ที่ปรับอุณหภูมิและช่วงเวลาเท่ากับ ปฏิกิริยา RAPD ต่างกันตรงที่ PCRI ของ AFLP ใช้จำนวนรอบเพียง 20 รอบ - จากนั้นนำมาเจือจางด้วยน้ำกลั่นที่นึ่งฆ่าเชื้อแล้ว 5 เท่า (108.8 ul) ก่อนทำปฏิกิริยา ใน PCRII

13 3. ทำการตรวจผลด้วย Agarose gel และ Acrylamide gel
โดยนำผลที่ได้จาก PCRII ผสมกับ Sequencing dyn 10 ul ได้ปริมาตร รวม 30 ul ใช้เพียง 10 ul เพื่อตรวจสอบผลขั้นต้นก่อน บน 1% Agarose gel ใน 0.5 x TBF Buffer ด้วยเครื่อง Mupid electrophoresis ขับเคลื่อน ด้วยกระแสไฟฟ้าแรงต่ำ 0.5 watt แล้วจึงไปตรวจผลที่แน่นอนบน 4.5% Acrylamide gel ใน 1 x TBF Bufferโดยเครื่อง Sequencer gel electrophoresis ขับเคลื่อนด้วย กระแสไฟฟ้าแรงสูง 50 watt ต่อ 1 gel เปรียบเทียบกับ maker Thinx 174 DNA/Hinf I นำเจลที่ได้ไปย้อม ด้วย ซิลเวอร์ เพื่ออ่านผลปฏิกิริยา AFLP

14 4. การย้อมเจลด้วยซิลเวอร์ (Silver staining)
1) Fixed ด้วย 10% Acetic acid นาน 20 นาที (ใช้ Shaker เขย่า) 2) ล้างด้วยน้ำกลั่นหรือน้ำกรองนาน 2 นาที 3 ครั้ง 3) ย้อมด้วย 1 g/L Silver nitrate ผสมกับ 37% formaldehyde 1.5 ml/L นาน 30-45 นาที ในที่มืด 4) ล้างด้วยน้ำกลั่นหรือน้ำกรอง แล้วรีบเทน้ำทิ้งทันที 5) Develop ด้วยสารละลาย developer จนกระทั่งเห็น band ชัดเจนดี แล้วเท developer ทิ้ง (ส่วนผสมของ developer ประกอบด้วย Sodium carbonate anhydrous 30 g. 10 mg/ml Sodium thiosulfate 250 ul 37% formaldehyde 1.5 ml. ในปริมาตรทั้งหมด 1 lite 6) Fixed ด้วย 10% acetic acid นาน 5 นาที 7) เทกรดอะซิติกทิ้ง แล้วล้างด้วยน้ำกลั่นอีกครั้งหนึ่งจนหมดกรดอะซิติก (ประมาณ 5 นาที) 8) นำแผ่นกระจกผึ่งให้แห้ง แล้วจึงอ่านผล

15 เย็นสอง Marker GV1 GV6 GV7 GV4 GV2 GV16 GV8 GV9 GV10 GV11 GV12 GV13 GV14 GV15 GV3 GV5 แป้นยักษ์ สาลี่สีทอง แป้นสีทอง กลมสาลี่ พบความแตกต่างของลายพิมพ์ดีเอ็นเอระหว่างสายต้นที่ระบุว่าเป็นพันธุ์เดียวกัน